人IL-10基因修飾骨髓間充質干細胞對異種淋巴細胞增殖影響的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 1.探討體外分離培養(yǎng)和擴增骨髓間充質干細胞(BMSCs)的有效方法。
　　 2.建立一個攜帶人白細胞介素10(hIL-10)的慢病毒載體系統(tǒng)(hIL-10/pLOX-cwGFP),并通過其介導hIL-10基因修飾間充質干細胞(MSCs)。
　　 3.體外驗證hIL-10修飾的MSCs(hIL-10-MSCs)抑制異種抗原誘發(fā)的脾淋巴細胞免疫反應性增殖及影響脾細胞分泌的功能,并探討其免疫抑制機制。

2、r>　　 方法:
　　 1.通過Fiocll分離法分離骨髓單個核細胞,體外貼壁培養(yǎng)擴增出MSCs。倒置顯微鏡觀察記錄細胞形態(tài)及細胞生長特征,CCK-8法定細胞生長曲線。采用流式細胞儀檢測MSCs表面標志CD29、CD34、CD44、CD45的表達,確認其分子表型。
　　 2.將hIL-10克隆基因片斷,經雙酶切后定向插入到慢病毒載體質粒(pLOX-cwGFP)中,慢病毒三質粒經脂質體法共轉染293T包裝細胞,獲得含有h

3、IL-10基因的重組慢病毒,并通過其來介導hIL-10修飾豚鼠MSCs。應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測hIL-10修飾豚鼠MSCs培養(yǎng)上清液中hIL-10表達水平。
　　 3.通過Fiocll分離法分離獲得大鼠和豚鼠的脾淋巴細胞及大鼠外周血單個核細胞(PBMC)。CCK-8法測定MSCs與hIL-10-MSCs對異種淋巴細胞增殖的影響。ELISA法測MSCs與hIL-10-MSCs培養(yǎng)上清液對大鼠PBMC分泌IFN-γ的

4、影響。
　　 結果:
　　 1.通過Fiocll分離法和貼壁篩選法結合,成功分離培養(yǎng)純化擴增MSCs。細胞生長旺盛,形態(tài)呈梭狀,均勻分布的漩渦狀生長。傳代周期7d左右,可在體外傳代15代以上,具有強大的增殖能力。流式細胞儀檢測第3代MSCs表面抗原高表達CD29、CD44;而低表達CD34、CD45。
　　 2.經基因測序顯示hIL-10/pLOX-cwGFP中hIL-10序列與基因庫中hIL-10序列相符合;通

5、過293T成功包裝出含有hIL-10基因的重組慢病毒;MSCs經病毒轉染后在熒光顯微鏡下可見黃綠色熒光。ELISA檢測hIL-10-MSCs組上清的hIL-10濃度明顯高于MSCs組。
　　 3.MSCs刺激異種脾淋巴細胞增殖反應的作用弱于淋巴細胞;MLR顯示,加入hIL-10修飾的和未修飾組的MSCs的淋巴細胞的增殖反應均弱于其他組;加入hIL-10-MSCs組的淋巴細胞的增殖反應均弱于未修飾組;ELISA檢測提示hIL-10