Desmuslin在原發(fā)性靜脈曲張發(fā)病機制中的作用.pdf

1、靜脈曲張是最常見的外周血管疾病，在30-70歲的人群中靜脈曲張的發(fā)病率高達10-40％。靜脈曲張除了影響美觀外還可以嚴重影響了病人的生活質(zhì)量及降低社會的勞動力。目前的治療手段包括手術治療，血管內(nèi)射頻及激光消融和泡沫硬化劑的注射，但是術后10年內(nèi)的復發(fā)率約為1/3，而后兩種方法雖然3年內(nèi)的治療效果與手術相似，但其遠期效果尚不得而知。因此從長遠的眼光來看，研究靜脈曲張發(fā)生的分子及細胞機制，對于尋找新的治療靶點及發(fā)展新的治療策略具有重要的意義

2、。
　　 近年來越來越多的證據(jù)表明原發(fā)性靜脈壁薄弱是靜脈曲張致病的始發(fā)因素。是什么導致了原發(fā)性靜脈壁的薄弱？正常情況下，膠原、彈性纖維及平滑肌細胞控制著靜脈壁的可擴張性，平滑肌細胞控制靜脈壁主動張力的維持，而膠原及彈性纖維控制著靜脈壁被動張力的維持，無論哪種成分有缺陷，都可以導致靜脈壁張力的喪失。從形態(tài)學及功能學上都有研究提示靜脈曲張病人的血管平滑肌細胞表型或者說其分化狀態(tài)發(fā)生了改變，而這種改變可以引起靜脈壁一系列的變化，包括靜

3、脈壁對內(nèi)源性血管收縮因子的反應的降低導致靜脈壁主動維持張力的能力下降及細胞外基質(zhì)的紊亂導致靜脈壁被動維持張力的能力下降，從而導致了靜脈壁的薄弱和擴張。但是以往的研究多通過電子顯微鏡觀察其超微結構的改變來推斷曲張靜脈平滑肌細胞發(fā)生的改變，也有研究通過培養(yǎng)的靜脈平滑肌細胞觀察其某一方面的功能，比如有研究比較曲張靜脈源性平滑肌細胞與正常靜脈源性平滑肌細胞膠原I及膠原III的合成，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的平滑肌細胞所合成的膠原可以反應組織中膠原的情況，體

4、外培養(yǎng)的平滑肌細胞在一定程度上保留了其在體內(nèi)的生物學特性，因此我們可以利用體外培養(yǎng)的平滑肌細胞來分析其在體內(nèi)的生物學特性。目前還沒有一個研究全面的探討靜脈曲張病人血管平滑肌細胞的生物學行為與正常靜脈平滑肌細胞之間的差別。
　　 有研究者認為靜脈曲張病人平滑肌細胞的生物學行為的改變有可能是因為基因的缺陷所造成的，因此它才能在體外培養(yǎng)時也表現(xiàn)出其異常的功能。流行病學研究也提示靜脈曲張的發(fā)病具有高度的遺傳傾向。近年來大量的研究已經(jīng)通過

5、不同的方法篩選曲張大隱靜脈與正常大隱靜脈差異表達的基因，試圖從中找出靜脈曲張致病相關基因。目前篩選出來的差異表達基因涉及到細胞代謝、細胞外基質(zhì)的組裝及細胞對外界刺激的反應包括細胞骨架、肌動蛋白的組裝等方面。但是這些差異表達的基因究竟在靜脈曲張的發(fā)病機制中發(fā)揮了什么作用，目前的報導很少。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)一種叫Desmuslin的基因在曲張靜脈中的表達明顯下調(diào)。Desmuslin又稱為β-synemin，是一種VI型中間絲

6、蛋白，最初被認為是α-dystrobrevin蛋白結合蛋白，α-dystrobrevin蛋白是dystrophin(抗肌萎縮蛋白)復合物(DAPC)的組成部分，DAPC是細胞外基質(zhì)與細胞內(nèi)骨架之間聯(lián)系的橋梁，為骨骼肌細胞提供機械支持，DAPC的病變與多種骨骼肌的遺傳性疾病相關。在平滑肌細胞中，中間絲蛋白與微管、微絲一起共同組成平滑肌的細胞三大骨架，長期以來中間絲蛋白網(wǎng)被認為只是維持機械完整性的固定的細胞結構，然而目前的研究認為中間絲細胞

7、骨架是一個動態(tài)的信號平臺，其生物學功能涉及細胞生長、分化及其它生物學行為的調(diào)節(jié)。動物模型表明中間絲蛋白是維持細胞構架及細胞機械完整性所必需的細胞骨架，它為細胞提供了一個柔韌的胞漿結構，使其可以耐受外界的不同刺激，中間絲蛋白功能的減弱引起細胞過度脆弱不能承受各種不同的生理刺激，可以導致多種遺傳性疾病。靜脈曲張病人中Desmuslin表達的下調(diào)是否導致了平滑肌細胞的功能的變化從而導致原發(fā)性靜脈壁薄弱及靜脈曲張的發(fā)生呢？
　　 本研究

8、是第一個通過比較體外培養(yǎng)靜脈曲張病人及正常大隱靜脈病人的平滑肌細胞全面評估平滑肌細胞生物學行為的研究，且本研究通過RNA干擾技術下調(diào)Desmuslin在正常大隱靜脈平滑肌細胞中的表達后觀察平滑肌細胞表型及功能的變化，從而探討Desmuslin與靜脈曲張發(fā)生及發(fā)展的關系。本研究是對前期研究篩選出來的靜脈曲張差異表達基因Desmuslin功能學的研究。在本研究中，我們假設靜脈曲張病人血管平滑肌細胞內(nèi)在生物學行為的改變是導致靜脈曲張發(fā)生的始發(fā)

9、因素，而我們發(fā)現(xiàn)靜脈曲張病人的平滑肌細胞具有的內(nèi)在特性包括增殖、遷移及細胞外基質(zhì)的合成功能的增強有利于靜脈曲張的形成，而Desmuslin的低表達可以導致正常平滑肌細胞表型及功能發(fā)生類似曲張靜脈源性平滑肌細胞的改變。因此我們認為在靜脈曲張的病人中由于Desmuslin的低表達，導致其中膜平滑肌細胞的內(nèi)在生物學特性的改變，不僅導致靜脈壁主動張力維持障礙，而且由于影響了細胞外基質(zhì)的周轉，導致了細胞外基質(zhì)的紊亂，也影響了靜脈壁被動張力的維持，

10、最終導致原發(fā)性的靜脈壁薄弱及靜脈曲張的形成。
　　 第一部分、體外培養(yǎng)曲張靜脈平滑肌細胞與正常靜脈平滑肌細胞生物學行為的區(qū)別
　　 目的：
　　 本研究的目的是通過比較體外培養(yǎng)的正常靜脈源性的平滑肌細胞與曲張靜脈源性平滑肌細胞生物學行為，探討靜脈中層平滑肌細胞在靜脈曲張發(fā)病中的作用。
　　 方法：
　　 1.分別收集原發(fā)性大隱靜脈曲張病人的大隱靜脈及無靜脈曲張病人的正常大隱靜脈，然后用貼塊法進行曲

11、張靜脈源性平滑肌細胞及正常靜脈源性平滑肌細胞的原代培養(yǎng)，并通過細胞形態(tài)及肌動蛋白免疫熒光染色法鑒定平滑肌細胞的純度。
　　 2.分別利用臺盼藍染色細胞計數(shù)法及氚標記的胸腺嘧啶核苷酸([3H]-Thymdine)摻入法比較兩組平滑肌細胞的增殖。
　　 3.利用劃痕實驗比較兩組平滑肌細胞的遷移能力。
　　 4.利用免疫印跡技術比較兩組細胞收縮表型依賴標志蛋白的表達。
　　 5.利用氚標記的脯氨酸([3H]-P

12、roline)摻入法比較兩組細胞總膠原的合成。
　　 6.利用酶聯(lián)免疫粘附實驗及免疫印跡技術分別檢測培養(yǎng)基內(nèi)及細胞層內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的濃度。
　　 7.采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析實驗結果。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗，各檢驗過程均以P≤0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.貼塊法培養(yǎng)的平滑肌細胞鏡下可見明顯特征性“峰-谷”樣生長。肌動蛋白免疫熒光法

13、鑒定平滑肌細胞及其純度，肌動蛋白染色陽性的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的90％以上。
　　 2.在生長曲線的第5-7天，曲張靜脈源性平滑肌細胞增殖明顯高于正常靜脈源性平滑肌細胞，平臺期時，曲張靜脈源性平滑肌細胞計數(shù)為正常靜脈源性平滑肌細胞計數(shù)的1.5倍。同代數(shù)的兩組平滑肌細胞相比曲張靜脈源性平滑肌細胞經(jīng)10％FBS刺激48h后DNA的合成約為正常靜脈源性平滑肌細胞的1.7倍。
　　 3.曲張靜脈源性平滑肌細胞比正常靜脈源性平滑肌細胞

14、表現(xiàn)出增強的遷移能力，發(fā)生遷移的細胞數(shù)約為正常靜脈源性平滑肌細胞的2.8倍。
　　 結論：
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的正常靜脈源性的平滑肌細胞與曲張靜脈源性的平滑肌細胞在表型和功能上確有不同，曲張靜脈源性平滑肌細胞表現(xiàn)出明顯增強的增殖、遷移、合成功能及明顯降低的收縮表型依賴性標志蛋白表達。我們的數(shù)據(jù)表明靜脈曲張病人的平滑肌細胞具有內(nèi)在的生物學特性，而正是這種特性有利于靜脈曲張的形成。
　　 第二部分、Des

15、muslin下調(diào)對平滑肌細胞表型的影響
　　 目的：
　　 本研究的目的是通過RNA干擾技術下調(diào)Desmuslin在正常大隱靜脈平滑肌細胞中的表達，觀察Desmuslin蛋白表達下調(diào)后平滑肌細胞表型及功能的變化，從而推斷該蛋白與靜脈曲張發(fā)生及發(fā)展中的關系。
　　 方法：
　　 1.利用RNA干擾技術下調(diào)Desmusiin基因在平滑肌細胞中的表達，并利用RT-PCR及Western blot檢測轉染效率。<

16、br>　　 2.利用Western blot比較下調(diào)Desmuslin基因的表達后平滑肌細胞收縮表型依賴標志蛋白的表達。
　　 3.利用[3H]-Proline摻入法比較下調(diào)Desmuslin的表達后總膠原的合成。
　　 4.分別利用酶聯(lián)免疫法及Western blot比較下調(diào)Desmuslin的表達培養(yǎng)基內(nèi)及細胞層內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的含量。
　　 5.免疫熒光染色法比較下調(diào)Desmuslin表

17、達后平滑肌肌動蛋白骨架的變化。
　　 6.采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析實驗結果。結果用平均值±標準差表示，多組之間的比較用單因素方差分析，兩組之間的比較用配對t檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 結論：
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在正常血管平滑肌細胞中下調(diào)Desmuslin的表達后，正常靜脈源性平滑肌細胞發(fā)生像曲張靜脈源性平滑肌細胞一樣去分化的改變，收縮表型標志性蛋白明顯下調(diào)及