基于多重置換擴(kuò)增的多倍點(diǎn)PCR分析與多重巢式PCR方法在單細(xì)胞水平診斷DMD的比較研究.pdf

1、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD; OMIM310200)是一種神經(jīng)肌肉系統(tǒng)常見的X-連鎖隱性遺傳病，主要累及男嬰，在存活男嬰中發(fā)病率約1/3500～1/6000，其主要臨床特征為緩慢進(jìn)行性加重的對(duì)稱性肌肉無(wú)力和萎縮，患者多起病于3～5歲，出現(xiàn)走路姿勢(shì)異常、易跌倒、肌無(wú)力等癥狀，12歲前喪失站立和行走能力，20歲左右死于呼吸困難、心力衰竭。本病是由位于Xp21.2的dystrophin基因

2、突變導(dǎo)致，該基因全長(zhǎng)約2.4Mb，約占X染色體全長(zhǎng)的1.5％，是目前人類已發(fā)現(xiàn)的最大基因，其cDNA全長(zhǎng)13974bp，共有79個(gè)外顯子，其編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量為32萬(wàn)道爾頓的肌養(yǎng)蛋白。近65％患者由一個(gè)或多個(gè)dystrophin基因外顯子的缺失所致，5％由重復(fù)突變導(dǎo)致，30％由點(diǎn)突變導(dǎo)致。
　　胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)可通過篩選正常的胚胎移植，以防止遺傳學(xué)

3、異常妊娠的發(fā)生，避免了反復(fù)流產(chǎn)、引產(chǎn)對(duì)孕婦及其家庭造成的傷害。
　　目前已有DMD-PGD相關(guān)報(bào)道，多重巢式PCR、連鎖分析、限制性酶切等方法都在其PGD考慮之中，但這些方法僅限于對(duì)單細(xì)胞幾個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行直接擴(kuò)增，有位點(diǎn)少、擴(kuò)增效率低、不能重復(fù)、條件要求高等缺點(diǎn)。對(duì)于臨床PGD十分不利，因此全基因組擴(kuò)增將模板量大幅提高，避免上述問題的產(chǎn)生。目前全基因組擴(kuò)增已發(fā)展出引物延伸預(yù)擴(kuò)增(Primer extension preamplific

4、ation，PEP)技術(shù)和簡(jiǎn)并寡核苷酸引物 PCR(Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chainreaction，DOP-PCR)技術(shù)及多重置換擴(kuò)增技術(shù)(multiple displacementamplification，MDA)。MDA技術(shù)已成為目前最有發(fā)展前景的WGA技術(shù)。
　　目的:
　　本研究通過使用多重巢式PCR和MDA的全基因組擴(kuò)增技術(shù)對(duì)4個(gè)DMD家系完成

5、PGD預(yù)實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化DMD-PGD預(yù)實(shí)驗(yàn)流程，并對(duì)多重巢式PCR和MDA-WGA方法對(duì)單細(xì)胞的擴(kuò)增效率及診斷準(zhǔn)確率和ADO發(fā)生率進(jìn)行評(píng)估，對(duì)DMD-PGD中現(xiàn)有的10個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行有效率評(píng)價(jià)，最后對(duì)其中存在的問題進(jìn)行討論分析。
　　材料:
　　本研究材料來自4個(gè)家系中患者或（和）其直系親屬，患者及相關(guān)成員外周血標(biāo)本于我院遺傳中心抽取，并進(jìn)行抽提gDNA和分離單淋巴細(xì)胞。
　　家系Ⅰ:分子編號(hào)M13742，家系中

6、女性攜帶者年齡34歲，生育一患兒，基因診斷提示女性攜帶者的dystrophin基因第12-16號(hào)外顯子雜合缺失;
　　家系Ⅱ:分子編號(hào)M5841，家系中女性攜帶者年齡41歲，生育一患兒，基因診斷提示女性攜帶者的dystrophin基因存在c.7705C＞T雜合無(wú)義突變，并曾經(jīng)行連鎖分析;
　　家系Ⅲ:分子編號(hào)M13501，家系中女性攜帶者年齡41歲，生育一患兒，14歲夭折，但未保留樣本，基因診斷提示女性攜帶者的dystrop

7、hin基因存在c.6318G＞A雜合無(wú)義突變，取女性攜帶者及其父母血樣;
　　家系Ⅳ:分子編號(hào)M13691，家系中僅有患兒，為新發(fā)生突變，基因診斷提示患兒的dystrophin基因存在第48-52號(hào)外顯子缺失，其母親則未見異常，年齡40歲。
　　方法:
　　1、制備單個(gè)淋巴細(xì)胞和抽提外周血gDNA
　　2、家系gDNA水平PCR擴(kuò)增和熒光-PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光電泳對(duì)DMD-STR位點(diǎn)2CA、5

8、CA、7CA、44CA、45CA、49CA、50CA、59CA、63CA、79CA進(jìn)行連鎖分析，確定能提供連鎖信息的位點(diǎn)。
　　3、單個(gè)淋巴細(xì)胞通過多重巢式PCR或MDA-WGA進(jìn)行初級(jí)擴(kuò)增
　　4、多重巢式PCR初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn)物和MDA純化產(chǎn)物各位點(diǎn)的熒光PCR的擴(kuò)增
　　5、通過測(cè)序儀熒光電泳對(duì)熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析及通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)缺失位點(diǎn)普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析
　　6、對(duì)需要測(cè)序的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化

9、及測(cè)序分析
　　結(jié)果:
　　1、單體型分析結(jié)果
　　家系Ⅰ單體型分析結(jié)果，能提供連鎖信息位點(diǎn)共4個(gè)，分別為5CA、44CA、45CA、50CA;家系Ⅱ單體型分析結(jié)果，能提供連鎖信息位點(diǎn)共3個(gè)，分別為44CA、49CA、50CA;家系Ⅲ單體型分析結(jié)果，能提供連鎖信息位點(diǎn)共4個(gè)，分別為7CA、44CA、50CA、63CA;家系Ⅳ單體型分析結(jié)果，能提供連鎖信息位點(diǎn)共6個(gè)，分別為2CA、5CA、44CA、45CA、59CA、6

10、3CA。
　　2、各家系單淋巴細(xì)胞擴(kuò)增效率及ADO率
　　家系Ⅰ共完成184個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增，擴(kuò)增成功及診斷準(zhǔn)確率99.5％(183/184)、ADO率為0，家系Ⅱ共完成153個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增，擴(kuò)增成功及診斷準(zhǔn)確率為99.3％(152/153)、ADO率為0，家系Ⅲ共完成180個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增，擴(kuò)增成功及診斷準(zhǔn)確率為100％(180/180)、ADO率為1.1％(178/180)，家系Ⅳ共完成480個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增，擴(kuò)增成功及診斷準(zhǔn)確率為9

11、9.8％(479/480)、ADO率為0。
　　3、多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的擴(kuò)增效率及ADO率比較
　　運(yùn)用多重巢式PCR擴(kuò)增方案總共擴(kuò)增產(chǎn)物337個(gè)，擴(kuò)增成功及診斷準(zhǔn)確率為99.4％(335/337)，ADO率為0(0/335);運(yùn)用MDA-WGA方案總共擴(kuò)增產(chǎn)物660個(gè)，擴(kuò)增成功率為99.8％(659/660)，ADO率為0.3％(2/659)。經(jīng)x2檢驗(yàn)，兩者擴(kuò)增成功率P＞0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AD

12、O率P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)共完成了4家DMD家系的PGD預(yù)實(shí)驗(yàn)，單細(xì)胞多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的各位點(diǎn)擴(kuò)增成功率均＞90％，ADO率均＜10％，達(dá)到臨床PGD要求，能夠應(yīng)用于臨床PGD，這為DMD患者的臨床PGD的開展提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。
　　2、雖然多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的擴(kuò)增成功率和ADO率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但MDA-WGA在多位點(diǎn)分析上更有優(yōu)勢(shì)，這樣