粥樣硬化性腎動脈狹窄炎癥性腎損害機制的實驗研究.pdf

1、研究背景： 粥樣硬化性腎動脈狹窄(ARAS)是腎動脈狹窄(RAS)最常見的病因。ARAS的進展導(dǎo)致腎動脈閉塞、腎小球濾過率(GFR)明顯下降和腎臟縮小時，診斷為缺血性腎病。目前認為重度腎動脈狹窄和缺血性腎病的病理生理變化是狹窄后腎缺血，不斷激活壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)(包括激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)、刺激腎上腺素分泌等)導(dǎo)致惡性高血壓發(fā)生和腎小球濾過功能喪失，腎動脈進行性狹窄是導(dǎo)致缺血性腎病的發(fā)生和進展至終末期的主要原因。現(xiàn)有研究成果表明：A

2、RAS是全身動脈粥樣硬化性疾病在腎動脈的表現(xiàn)，而心血管領(lǐng)域的研究早已證實動脈粥樣硬化病變的實質(zhì)是慢性進展性炎癥反應(yīng)，動脈粥樣硬化斑塊的形成、破裂及進行性增大與慢性進展性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)；臨床觀察到輕中度ARAS其腎動脈狹窄程度與腎損害嚴重程度并非完全平行；國外學(xué)者業(yè)已在臨床研究中發(fā)現(xiàn)ARAS患者腎動脈狹窄并不是導(dǎo)致腎實質(zhì)損害的主要原因，推測ARAS患者的慢性腎損害可能是由血管狹窄以外的其它因素所致。這些研究結(jié)果提示我們：導(dǎo)致動脈粥樣硬化

3、的炎癥反應(yīng)是否同時作用于腎實質(zhì)?除腎動脈狹窄引起腎臟慢性缺血性損害以外是否有炎癥因素參與其下游腎臟實質(zhì)的慢性損害? 由此本文設(shè)想：①炎癥反應(yīng)可能是ARAS腎損害進展的重要機制之一；②通過下游腎臟病理的變化、腎功能損傷程度以及預(yù)測因子的動態(tài)變化，可預(yù)測上游ARAS的活動情況，為臨床提供早期的治療時機；③解除和延緩腎動脈狹窄同時控制可能存在的炎癥反應(yīng)也許會成為更有效的治療策略。 為驗證這些設(shè)想，選擇ApoE-/-小鼠--目前

4、世界公認的研究動脈粥樣硬化(AS)的成熟動物模型來建立ARAS模型，動態(tài)觀察ApoE-/-小鼠在ARAS發(fā)病過程中腎臟損害的特點；對ApoE-/-小鼠ARAS腎臟炎癥損害機制進行實驗研究；探討Rapamycin對ApoE-/-小鼠ARAS腎損害進展的干預(yù)作用；在動物實驗研究的基礎(chǔ)上，驗證炎癥機制在ARAS患者腎損害中的重要作用，并對腎動脈支架置入術(shù)時機進行初步的探討。 主要實驗方法及結(jié)果： 一、ARAS小鼠模型的建立及A

5、RAS腎損害特點觀察 選取同周齡C57BL/6JApoE基因敲除小鼠及C57BL/6J野生型小鼠，取材25周齡至51周齡小鼠的腎動脈和腎臟，腎動脈連續(xù)切片、V.G染色，通過ImagePro-Plus圖像分析系統(tǒng)(MediaChemeticsInc.USA)測量、計算腎動脈的狹窄程度。根據(jù)ARAS程度分3組(A組：＜50％；B組：50％-75％；C組：＞75％)。A組又根據(jù)斑塊是否破裂分為A1(未破裂)和A2(破裂)組。腎臟常規(guī)H

6、E、PAS和Masson染色，采用電鏡及普通光鏡動態(tài)觀察各組ApoE-/-小鼠腎動脈病變及相應(yīng)的腎臟病變。結(jié)果：1、利用ApoE-/-小鼠成功建立了粥樣硬化性腎動脈狹窄動物模型；2、腎動脈和腎臟的變化是：①A1組未發(fā)現(xiàn)其下游腎臟病理改變；②A2組其下游腎內(nèi)腎小管周圍毛細血管減少，腎小管上皮細胞腫脹，電鏡下可見細胞內(nèi)線粒體腫脹；③B組和C組己發(fā)生斑塊破裂，其腎內(nèi)腎小管周圍毛細血管減少明顯，與A2組比較，差異顯著(p＜0.01，p＜0.00

7、1)；腎小管上皮細胞腫脹、脫落、壞死；腎小管間質(zhì)病變嚴重；④微血栓形成；⑤斑塊破裂后，腎動脈狹窄程度與腎小管周圍毛細血管(PTC)密度、腎小管間質(zhì)損傷(TI)程度明顯負相關(guān)，PTC密度與TI程度明顯負相關(guān)。 結(jié)論：選擇ApoE-/-小鼠成功建立ARAS模型；ARAS是進展性疾??；腎損害的出現(xiàn)不僅僅是狹窄造成的缺血性損害，缺血以外的損傷機制參與其中，極有可能是動脈粥樣硬化病變的慢性進展性炎癥反應(yīng)。為此在實驗第二部分對腎損害的炎癥機

8、制進行探討。 二、ApoE-/-小鼠腎動脈粥樣硬化病變進展導(dǎo)致下游腎損害的炎癥機制 1、腎動脈粥樣硬化病變活動造成腎損害的炎癥因素的測定：選擇各組ApoE-/-小鼠為實驗組，同期喂養(yǎng)的野生型C57BL/6J小鼠作為對照組。取各組腎動脈及腎臟：采用Westemblotting及免疫組化法檢測NF-κBp65、ICAM-1及P-sel表達；ELISA檢測IL-6和TF的表達；RT-PCR檢測IL-6mRNA測定；免疫組化法檢

9、測巨噬細胞表達；采用激光共聚焦顯微鏡檢測促炎癥反應(yīng)優(yōu)勢的單核巨噬細胞在各組小鼠腎組織中分布變化。 2、ApoE-/-小鼠ARAS腎損傷與炎癥因素的關(guān)系：分別取各實驗組及對照組的腎組織，免疫組化方法檢測α-SMA：偏振光顯微鏡觀察ColⅠ、ColⅢ在腎組織中表達情況；酶-底物直接顯色法檢測尿NAG；全自動生化分析儀檢測血肌酐。研究炎癥因素與腎臟纖維化及腎功能損害的相關(guān)性。 結(jié)果：1、NF-κBp65在ARAS50％-75％

10、的B組表達顯著高于ARAS小于50％斑塊已破裂的A2組，A2組明顯高于ARAS小于50％斑塊未破裂的A1組，而A1組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；其受控因子ICAM-1、P-sel、IL-6的表達變化與NF-κBp65的表達變化相似即B組表達顯著高于A2組，A2組明顯高于A1組，而A1組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；巨噬細胞及α-SMA的表達變化也與NF-κBp65的表達變化相似；尿NAG測定量變化也與NF-κBp65的表達變化相似

11、。2、巨噬細胞在：A2亞組和B組的促炎優(yōu)勢單核巨噬細胞在腎小管間質(zhì)及腎小球均有分布，但主要分布于腎小管、腎間質(zhì)和腎血管，以腎間質(zhì)最為明顯；其分布數(shù)量于B組較A2組呈明顯增多，且與腎功能減退呈正相關(guān)。B組腎小管間質(zhì)區(qū)α-SMA及Ⅰ型膠元(ColⅠ)、ColⅢ蛋白質(zhì)表達均明顯增加，并與TIF程度以及促炎優(yōu)勢單核巨噬細胞分布數(shù)量呈正相關(guān)。對照組和A1亞組促炎優(yōu)勢單核巨噬細胞分布及數(shù)量明顯少于A2組和B組，α-SMA、Ⅰ型膠元(ColⅠ)、Co

12、lⅢ蛋白質(zhì)表達明顯少于A2組和B組，無腎小管間質(zhì)損害表現(xiàn)，腎功能正常。 結(jié)論：炎癥反應(yīng)是ARAS進行性狹窄及其下游腎損害進展的重要機制之一。炎癥反應(yīng)在導(dǎo)致ARAS的同時，也同樣損傷腎實質(zhì)，因此炎癥反應(yīng)伴隨在ARAS及其腎損害的始終，炎癥機制是始動因素，缺血機制在后，共同控制著下游的腎損害。當(dāng)ARAS到一定程度，缺血因素發(fā)生，同時又會促進下游炎性腎損害加劇，如此惡性循環(huán)導(dǎo)致ARAS腎損害加劇。為了進一步證實這一重要的炎癥機制，我們

13、在實驗第三部分通過藥物控制這種炎癥反應(yīng)，觀察是否可以延緩ARAS腎損害的進程? 三、免疫抑制劑雷帕霉素對ApoE-/-小鼠ARAS腎損害進展的干預(yù)作用。 由于雷帕霉素可以抑制淋巴細胞的活化而控制炎癥反應(yīng)，同時雷帕霉素涂層支架在治療動脈粥樣硬化性狹窄后可以控制炎癥反應(yīng)，近期初步的臨床實驗證實雷帕霉素可以延緩慢性增殖性腎病，所以我們選擇雷帕霉素作為本試驗炎癥反應(yīng)控制藥物。 1、體內(nèi)實驗：選擇①33周齡組ApoE-/-

14、小鼠；②藥物組：33周齡ApoE-/-小鼠，予雷帕霉素100μg/kg(Bw)/day灌胃8周至41周齡；③41周齡組ApoE-/-小鼠；④對照組：41周齡野生型C57BL/6J小鼠。每組6只，均為雄性。檢測各組腎動脈的狹窄程度、腎動脈和腎臟M1型巨噬細胞浸潤情況、NF-κBp65及IL-6mRNA的表達情況及腎臟纖維化程度。 2、體外培養(yǎng)：采用雷帕霉素及LPS共同刺激小鼠腹腔巨噬細胞，檢測各組小鼠腹腔巨噬細胞的NF-κBp65

15、和MHCⅡ的表達情況及IL-6mRNA的轉(zhuǎn)錄水平變化。研究雷帕霉素對單核巨噬細胞促炎癥優(yōu)勢的影響。 結(jié)果：1、雷帕霉素能顯著下調(diào)ApoE-/-小鼠腎臟α-SMA和Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的表達；顯著減少腎動脈斑塊處及腎臟間質(zhì)M1型巨噬細胞浸潤數(shù)量；下調(diào)腎動脈及腎臟組織NF-κBp65的表達；減少NF-κBp65下游IL-6的表達。2、小鼠巨噬細胞經(jīng)LPS刺激1h后，其核內(nèi)的熒光強度(代表的NF-κBp65表達量)顯著增強.與LPS刺激

16、組相比，不同濃度的雷帕霉素+LPS組均能使NF-κBp65的熒光強度值降低，有顯著性差異，雷帕霉素使NF-κBp65的熒光強度值降低呈劑量依賴性。 結(jié)論：雷帕霉素可以控制ARAS所致的腎臟炎癥反應(yīng)，延緩腎臟纖維化，再次證實ApoE-/-小鼠ARAS腎損害的重要發(fā)生機制之一是炎癥反應(yīng)。 四：臨床實驗：在臨床ARAS患者中初步驗證動物實驗結(jié)論。觀察尿NAG/Ucr、尿液巨噬細胞陽性率、腎活檢應(yīng)用于ARAS篩查及監(jiān)測治療效果的

17、可能性。檢測17例ARAS患者、20例合并≥2項動脈粥樣硬化危險因素的動脈粥樣硬化疾病患者及20例同年齡健康者的尿NAG/Ucr、尿液巨噬細胞陽性率、ARAS組行3例腎活檢等檢測腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)指標(biāo)，觀察支架置入術(shù)前后及未行支架術(shù)患者的尿NAG/Ucr、尿液巨噬細胞陽性率的變化。 結(jié)果：1、尿NAG/UCr、尿液巨噬細胞陽性率能反映ARAS腎小管間質(zhì)的受損情況，對監(jiān)測ARAS進展及觀察支架術(shù)治療的效果有一定幫助，但與ARAS狹

18、窄程度不一定完全平行；2、3例腎活檢提示ARAS患者腎損害的重要發(fā)生機制仍然是炎癥反應(yīng)，其首先累及腎小管間質(zhì)。由于收集樣本時間有限造成樣本量過小，需加進一步大樣本量研究。 結(jié)論：尿NAG/UCr、尿液巨噬細胞陽性率及腎臟病理可以作為預(yù)測ARAS活動的指標(biāo)，提示控制炎癥治療和放置血管支架的時機。 全文結(jié)論：炎癥反應(yīng)是ARAS病變及其下游非缺血腎損害的重要機制之一。早期控制炎癥反應(yīng)不但可以延緩或阻斷ARAS的進展，同時也是保