藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞脂代謝紊亂所產生的ROS誘導細胞內保護性自噬發(fā)生的機制研究.pdf

1、結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高居世界惡性腫瘤的第三位，死亡率居第四位。到目前為止，對于晚期或已經發(fā)生侵潤轉移的結直腸癌患者來說，有效的治療措施很有限，故新的低毒高效的化療藥物開發(fā)及綜合性治療策略制訂顯得尤其重要。藤黃酸是藤黃科植物藤黃樹脂中的主要活性成分，在過去的半個世紀以來，藥理學研究已經揭示了藤黃酸對多種腫瘤顯示出了強大的抗腫瘤活性，如白血病、肝癌、頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、宮頸癌和肺癌等。近年來，有報道

2、稱藤黃酸在體內、體外均顯示出了對結直腸癌細胞顯著的抗癌活性。由于藤黃酸具有廣譜的抗腫瘤作用，且對體內正常細胞的毒性作用很小，它已經被中國食品和藥物管理局批準作為廣譜的抗腫瘤藥物進行臨床試驗，目前Ⅱ期臨床試驗已經完成。但是，有關藤黃酸精細的抗瘤機制目前尚不清楚，還有待進一步研究。
　　在本課題中，利用MTT實驗結果顯示藤黃酸對結直腸癌細胞具有增殖抑制的作用。利用流式細胞術及TUNEL實驗結果顯示藤黃酸主要是通過caspase-3途徑

3、誘導結直腸癌細胞凋亡。在體外細胞實驗中，利用電子顯微鏡可觀察到藤黃酸可誘導結直腸癌細胞內自噬泡形成；利用吖啶橙染色可觀察到藤黃酸誘導結直腸癌細胞內酸性膜泡（Acidic Vesicular Organelles,AVO）的形成；通過外源性轉染GFP-LC3，利用熒光顯微鏡可觀察到結直腸癌細胞內自噬斑點聚集現(xiàn)象；利用免疫印跡檢測到藤黃酸能誘導結直腸癌細胞內LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，且具有藥物濃度及時間依賴性；利用免疫印跡檢測到藤黃酸能誘

4、導結直腸癌細胞內Atg5-Atg12、Atg7及Beclin1等自噬相關蛋白的表達；通過鼠源的C26細胞建立了小鼠皮下移植瘤模型，每次加藥前稱量小鼠體重及測量皮下瘤體表面積，處死小鼠后取下瘤塊，稱量瘤塊重量，通過統(tǒng)計學分析可獲知藤黃酸具有明顯的抑瘤效應；通過免疫印跡及免疫組化檢測瘤塊中 Caspase-3及LC3-Ⅱ表達情況，證實了藤黃酸同樣可在體內誘導結直腸癌細胞發(fā)生自噬與凋亡。以上實驗結果說明藤黃酸在體內、體外都能同時誘導結直腸癌細

5、胞自噬與凋亡發(fā)生。利用3-MA或si-Atg5、si-Beclin1抑制細胞自噬發(fā)生后，可明顯增強藤黃酸誘導的細胞增殖抑制和細胞凋亡，說明細胞自噬在藤黃酸抗瘤過程中對腫瘤細胞起著保護性作用。利用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒檢測到藤黃酸能誘導結直腸癌細胞內ROS積聚，利用NAC抑制細胞內ROS產生后，通過外源性轉染GFP-LC3，熒光顯微鏡下可觀察到藤黃酸誘導的自噬斑點明顯減少；通過免疫印跡檢測到LC3-Ⅱ表達明顯減少；這些實驗結果說明

6、藤黃酸是通過引發(fā)結直腸癌細胞內產生的ROS來誘導細胞自噬發(fā)生。通過蛋白組學方法—雙向電泳揭示了藤黃酸治療組改變了多種氧化還原蛋白及脂代謝調節(jié)蛋白的表達。為了進一步闡明藤黃酸誘導產生的ROS積聚是否與脂代謝紊亂相關，我們分別通過特異性抑制NADPH氧化酶（NOX）、線粒體氧化呼吸鏈及LOX來源的ROS抑制劑，利用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)藤黃酸引發(fā)產生的ROS來源于LOX。利用免疫印跡檢測p-mTOR、p-Akt及p-P70S

7、6K,證實藤黃酸是通過引發(fā)結腸癌細胞內ROS積聚，抑制Akt-mTOR信號通路，從而誘導細胞自噬發(fā)生。
　　通過上述實驗研究結果表明，藤黃酸作為一種抗癌的天然藥物，對結直腸癌細胞具有明顯的抑瘤效應；另外，藤黃酸還可同時誘導結直腸癌細胞發(fā)生自噬和凋亡，且細胞自噬在藤黃酸抗結直腸癌過程中起著保護性角色，如果在藤黃酸處理結直腸癌細胞的過程中同時抑制細胞自噬發(fā)生，藤黃酸的抗瘤效果將會明顯增強。藤黃酸誘導細胞自噬發(fā)生的分子機制是：通過引發(fā)結

8、直腸癌細胞內脂代謝紊亂而產生過多ROS，并通過抑制Akt-mTOR信號通路，從而誘導細胞自噬發(fā)生。本課題通過闡明藤黃酸誘導結直腸癌細胞發(fā)生細胞自噬的分子機制，為臨床上藤黃酸聯(lián)合細胞自噬抑制劑協(xié)同抗瘤提供了理論基礎。本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分
　　目的：探討藤黃酸在體內外對結直腸癌細胞的抗癌活性及誘導細胞自噬的作用，闡明藤黃酸誘導的細胞自噬對其抗癌效果的影響。
　　方法：檢測藤黃酸對結直腸癌細胞的增殖抑

9、制效應及是否誘導結直腸癌細胞凋亡：利用MTT法評估藤黃酸對結直腸癌細胞增殖的抑制效應；利用流式細胞術及TUNEL法檢測藤黃酸誘導結直腸癌細胞凋亡的效果；利用免疫印跡檢測藤黃酸誘導結直腸癌細胞凋亡過程中 caspase-3表達情況。檢測藤黃酸是否誘導結直腸癌細胞自噬的發(fā)生：利用電鏡檢測藤黃酸是否誘導結直腸癌細胞中自噬膜泡的形成；利用吖啶橙染色檢測藤黃酸是否誘導結直腸癌細胞中酸性膜泡（AVO）形成；利用外源性GFP-LC3轉染入結直腸癌細胞

10、中，通過熒光顯微鏡下觀察細胞內聚集的自噬斑形成；通過免疫印跡檢測藤黃酸誘導結直腸癌細胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化情況；通過免疫印跡檢測藤黃酸誘導結直腸癌細胞中自噬相關蛋白Atg5-Atg12、Atg7、Beclin1的表達情況。檢測結直腸癌細胞中藤黃酸誘導的細胞自噬對其抗癌效果的影響：利用3-MA或siAtg5、siBeclin1抑制藤黃酸誘導的細胞自噬，通過 TUNEL檢測藤黃酸誘導細胞凋亡情況。通過體內實驗檢測藤黃酸的抗瘤效果及是

11、否同時誘導結直腸癌細胞自噬與細胞凋亡發(fā)生：建立小鼠皮下瘤模型，通過每次注射藥物前測量小鼠體重及瘤塊面積，處死小鼠取下皮下瘤后測量瘤塊重量，利用統(tǒng)計學方法分析藤黃酸在體內實驗中的抑瘤效果；利用免疫組化及免疫印跡檢測caspase-3及LC3-Ⅱ的表達情況，闡明藤黃酸在體內是否誘導細胞自噬及細胞凋亡的發(fā)生。
　　結果：藤黃酸抑制結直腸癌細胞增殖、誘導結直腸癌細胞凋亡：MTT結果顯示，藤黃酸明顯抑制結直腸癌細胞增殖；流式細胞術及 TUN

12、EL實驗結果顯示藤黃酸具有顯著的抗癌效果（誘導結直腸癌細胞凋亡）；免疫印跡檢測顯示，藤黃酸誘導結直腸癌細胞凋亡是通過 caspase-3途徑實現(xiàn)的。藤黃酸誘導結直腸癌細胞自噬的發(fā)生：電鏡結果顯示，藤黃酸誘導結直腸癌細胞中自噬膜泡（雙層膜泡，細胞自噬的形態(tài)學標志物之一）的形成；吖啶橙染色顯示，藤黃酸誘導結直腸癌細胞中酸性膜泡（AVO,細胞自噬的另一形態(tài)學標志物）形成；外源性 LC3轉染入結直腸癌細胞后，通過熒光顯微鏡可觀察到聚集的自噬斑形

13、成；通過免疫印跡檢測顯示，藤黃酸可誘導結直腸癌細胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化（自噬現(xiàn)象發(fā)生的標記）。藤黃酸可誘導結直腸癌細胞發(fā)生保護性自噬：利用3-MA或siAtg5、siBeclin1抑制藤黃酸誘導的細胞自噬后，藤黃酸誘導的細胞凋亡現(xiàn)象明顯增強，說明藤黃酸誘導的細胞自噬拮抗細胞凋亡。體內實驗證實藤黃酸誘導結直腸癌細胞發(fā)生細胞自噬和細胞凋亡：利用結直腸癌細胞 C26建立小鼠皮下瘤模型，每次注射藥物前測量皮下瘤面積及稱量小鼠體重，取瘤后

14、稱量小鼠皮下瘤重量，通過統(tǒng)計學分析可得出結論：藤黃酸在體內具有明顯的抑制腫瘤細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡的作用；通過免疫組化及免疫印跡檢測證實藤黃酸在體內也可同時誘導結直腸癌細胞發(fā)生細胞自噬及caspase-3途徑的細胞凋亡。
　　結論：藤黃酸在抗結直腸癌過程中誘導腫瘤細胞發(fā)生保護性自噬。
　　第二部分
　　目的：闡明藤黃酸誘導結直腸癌細胞發(fā)生細胞自噬的分子機制。
　　方法：利用DCFH-DA ROS檢測試劑盒檢測

15、藤黃酸是否引發(fā)結直腸癌細胞內ROS積聚現(xiàn)象；通過ROS廣譜抑制劑NAC抑制結直腸癌細胞內ROS產生，利用外源性轉染GFP-LC3入結直腸癌細胞內，在熒光顯微鏡下觀察藤黃酸是否誘導胞內形成聚集的自噬斑點；通過ROS廣譜抑制劑NAC抑制結直腸癌細胞內ROS產生，利用免疫印跡檢測藤黃酸誘導結直腸癌細胞內LC3-Ⅱ表達情況；利用蛋白組學方法—雙向電泳篩選結直腸癌細胞內藤黃酸處理組與藤黃酸未處理組之間差異性表達的蛋白質；為了檢測藤黃酸引發(fā)結直腸癌

16、細胞內產生ROS的來源，分別利用線粒體氧化呼吸鏈、NADPH氧化酶(NOX)及LOX來源的ROS抑制劑Rot、Apo及NDGA特異性抑制結直腸癌細胞內相關來源的ROS產生，通過DCFH-DA ROS檢測試劑盒分別檢測藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞內ROS產生情況，通過免疫印跡檢測LC3-Ⅱ表達情況；利用免疫印跡檢測藤黃酸誘導結直腸癌細胞中p-Akt、p-mTOR及p-70S6K的表達情況，以便闡明藤黃酸誘導結直腸癌細胞發(fā)生細胞自噬的分子機制。<

17、br>　　結果：藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞內產生ROS：通過熒光顯微鏡及分光光度法可以檢測到藤黃酸能明顯誘導結直腸癌細胞產生ROS積聚。藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞產生的ROS誘導細胞自噬發(fā)生：通過ROS廣譜抑制劑NAC抑制結直腸癌細胞內ROS產生后，利用外源性GFP-LC3轉染結直腸癌細胞，熒光顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)藤黃酸誘導結直腸癌細胞內自噬斑形成明顯減少；利用免疫印跡檢測到藤黃酸誘導結直腸癌細胞內轉化形成的LC3Ⅱ明顯減少；以上結果說明藤黃酸誘導產

18、生的細胞自噬與藤黃酸引發(fā)胞內ROS集聚密切相關。藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞內產生的ROS可能與氧化還原反應及脂代謝紊亂相關：雙向電泳檢測到藤黃酸處理組與藤黃酸未處理組之間差異表達的蛋白質，通過質譜分析并進行亞細胞定位或生物學功能進行分類，其中氧化還原調節(jié)蛋白占25％，與脂代謝相關蛋白占17％，雙向電泳及質譜分析所得的結果提示藤黃酸可能引發(fā)結直腸癌細胞內氧化還原反應及脂代謝紊亂，細胞內產生的ROS可能與脂代謝紊亂相關。藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞產

19、生的ROS來源于LOX:利用線粒體氧化呼吸鏈、NADPH氧化酶及LOX來源的ROS抑制劑Rot、Apo及NDGA特異性抑制結直腸癌細胞內相關來源的ROS產生后，通過使用DCFH-DA ROS檢測試劑盒，可檢測到LOX抑制劑NDGA可明顯抑制結直腸癌細胞內ROS產生；免疫印跡結果表明NDGA可明顯抑制結直腸癌細胞內LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，說明ROS產生的來源是LOX。藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞內產生的ROS通過抑制Akt-mTOR信號通路

20、而誘導細胞自噬發(fā)生：免疫印跡檢測到藤黃酸處理過的結直腸癌細胞中p-Akt、p-mTOR及p-70S6K的表達明顯明顯降低，且具有濃度依賴性和時間依賴性，說明藤黃酸是通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路，誘導細胞自噬發(fā)生；通過ROS廣譜抑制劑NAC或LOX抑制劑NDGA分別抑制結直腸癌細胞內ROS產生，均可導致p-Akt、p-mTOR及p-P70S6K的表達明顯增強，說明藤黃酸引發(fā)結直腸癌細胞內ROS積聚可抑制PI3K-Akt-mT