亞硒酸鈉在結腸癌細胞中誘導氧化還原依賴的Bax激活與細胞凋亡的研究.pdf

1、很多證據表明硒化合物具有抑制腫瘤發(fā)生的化學預防作用，最近研究表明硒化合物可能具有成為化療藥物用于腫瘤治療的潛能，在一定劑量范圍內對腫瘤細胞具有一定的選擇性抑制生長和誘導凋亡的作用而正常細胞耐受較好。結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率呈上升趨勢，本文利用多種體外培養(yǎng)的結腸癌細胞系和裸鼠結腸癌移植瘤模型證明超營養(yǎng)劑量的亞硒酸鈉在體內體外均能誘導細胞凋亡。亞硒酸鈉誘導細胞凋亡的機理目前仍不很清楚，本文研究了Bcl—2家族蛋白在亞硒酸鈉

2、誘導凋亡過程中發(fā)揮的作用，并進一步分析了亞硒酸鈉誘導Bax激活的分子機制。 通過多種細胞凋亡檢測技術，在SW480、HCT116、HT29三種結腸癌細胞系中證明5—10μM亞硒酸鈉能誘導典型細胞凋亡，并誘發(fā)細胞色素C從線粒體釋放至胞漿，說明內源性線粒體凋亡通路被激活。Bcl—2家族蛋白是重要的細胞凋亡調節(jié)因子，其與線粒體凋亡通路具有密切聯系，在SW480細胞凋亡的研究中發(fā)現亞硒酸鈉能誘導Bax從胞漿轉位至線粒體，本文主要研究Ba

3、x這個關鍵分子在亞硒酸鈉誘導細胞凋亡中的作用。將GFP標記的Bax在SW480細胞中穩(wěn)定表達，構建了可實時觀察Bax功能狀態(tài)變化的細胞模型。利用這個模型，進一步發(fā)現亞硒酸鈉誘導了Bax構象變化、遷移至線粒體、多聚體形成和細胞色素C釋放這一系列事件，并明確了這些事件的先后順序。在此體系中高表達抗凋亡Bcl—2家族成員Bcl—xL能顯著抑制亞硒酸鈉誘導的Bax構象變化、遷移至線粒體、多聚體形成和細胞色素C釋放。在明確亞硒酸鈉激活Bax這一現

4、象之后，利用基因缺失的細胞模型分析了Bax對于亞硒酸鈉誘導細胞凋亡的重要性。Bax/Bak雙缺失的MEF細胞與野生型MEF細胞相比對亞硒酸鈉誘導的細胞死亡具有很強抗性，Bax單缺失的HCT116結腸癌細胞與野生型HCT116細胞相比對亞硒酸鈉誘導的細胞死亡敏感性降低，說明Bax是亞硒酸鈉誘導細胞死亡的重要介導分子。 本文進一步分析了亞硒酸鈉誘導Bax激活的分子機制，發(fā)現在SW480細胞中亞硒酸鈉能誘導細胞內ROS水平持續(xù)性升高。

5、在穩(wěn)定表達GFP—Bax的SW480細胞中，MnSOD活性類似物MnTMPyP能抑制亞硒酸鈉誘導的Bax激活，而GSH前體NAC和GSH耗竭劑BSO兩種化合物在促進亞硒酸鈉誘導的ROS水平升高的同時也促進Bax激活。在尋找亞硒酸鈉誘導Bax激活的線索過程中，發(fā)現通過氧化應激使Bim表達上調可能是Bax激活的機制之一。除此之外，進一步利用Biotin標記的巰基修飾劑檢測Bax氧化還原狀態(tài)發(fā)現，亞硒酸鈉在SW480細胞中能誘導Bax自由巰基

6、氧化，而MnTMPyP能抑制Bax巰基氧化。這些現象提示亞硒酸鈉可能通過內源性ROS直接改變Bax的氧化還原狀態(tài)，其中半胱氨酸的修飾可能發(fā)揮了關鍵作用。利用定點突變技術，構建了Bax序列上兩個保守半胱氨酸位點突變的表達載體(C62/126SGFP—Bax)，并與野生型GFP—Bax—樣在SW480細胞中穩(wěn)定表達，實時比較野生型和突變體Bax對亞硒酸鈉反應的差別。62/126位半胱氨酸突變抑制了亞硒酸鈉和H2O2誘導的Bax構象變化、遷移

7、至線粒體、多聚體形成和細胞色素C釋放，但不能抑制DNA拓撲酶抑制劑Etoposide和Camptothecin誘導的Bax激活和細胞色素C釋放。這些結果提示亞硒酸鈉可能通過內源性ROS介導改變62/126位半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)，誘導Bax構象變化而使其激活。 5—10μM亞硒酸鈉在體外雖能顯著誘導結腸癌細胞凋亡，但對原代培養(yǎng)的人胚胎腸粘膜上皮細胞凋亡誘導作用較弱。進一步建立了結腸癌動物模型，在整體動物水平觀察亞硒酸鈉對結腸癌的