血管內(nèi)皮細胞hCASK-Id1通路對p53表達調(diào)控的機制研究.pdf

1、研究背景： 多臟器功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是嚴重燒傷病人死亡的重要原因之一，它的發(fā)生和發(fā)展與燒傷嚴重程度、燒傷后休克期渡過是否平穩(wěn)以及燒傷感染有密切關(guān)系，提高燒傷的救治水平，必須重視MODS的防治。組織血液灌流不足及細胞缺血缺氧性損害是嚴重燒傷后臟器功能損害的病理生理基礎(chǔ)。燒傷后多種因素可導致血管內(nèi)皮細胞的激活和損傷，損傷的血管內(nèi)皮細胞使毛細血管通透性增加

2、，導致臟器間質(zhì)水腫，加重臟器的缺血缺氧性損害。同時，激活的血管內(nèi)皮細胞還可釋放大量的細胞因子、炎癥介質(zhì)，直接參與炎癥反應(yīng)、影響血管的收縮/舒張平衡、導致血液的高凝狀態(tài)、促進中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附。黏附的中性粒細胞可釋放多種炎癥介質(zhì)加重血管內(nèi)皮細胞的損傷，使微循環(huán)功能障礙加重，進一步減少重要臟器的血供和氧氣交換，最終導致多臟器功能不全綜合征?？梢哉f，血管內(nèi)皮細胞活化與損傷是導致燒傷、創(chuàng)傷后器官功能障礙的中心環(huán)節(jié)之一。 內(nèi)皮

3、細胞的損傷早期表現(xiàn)為細胞活化，此時細胞釋放大量細胞因子和炎癥介質(zhì)參與全身的炎癥反應(yīng)。當損傷因素得不到及時糾正時，內(nèi)皮細胞損傷加重，自血管壁剝脫、死亡，內(nèi)皮下膠原纖維暴露引發(fā)血管內(nèi)凝血，進一步加重微循環(huán)障礙。微循環(huán)功能的恢復依賴血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能的修復，因此，如何加速損傷內(nèi)皮細胞的修復是燒傷后臟器功能障礙防治研究的重要內(nèi)容之一。 損傷修復過程涉及細胞的運動、黏附、通訊、增殖和分化，也包含細胞內(nèi)外物質(zhì)代謝基因的啟動、調(diào)控等一系列

4、生化和分子生物學反應(yīng)。細胞的增殖反應(yīng)是其中重要環(huán)節(jié)之一，許多細胞因子及信號轉(zhuǎn)導通路參與這個復雜的過程，它們相互促進、制約，共同發(fā)揮作用。如果能全面揭示細胞增殖調(diào)控的信號網(wǎng)絡(luò)，我們就可以主動參與內(nèi)皮細胞損傷的修復進程，在治療大面積燒創(chuàng)傷、防治內(nèi)臟并發(fā)癥時就可以掌握主動權(quán)。 CASK是膜相關(guān)鳥苷酸激酶同源家族(membrane-associated guanylate kinasehomologs family，MAGuK)成員，

5、主要功能是作為腳手架蛋白質(zhì)(scaffold protein)，利用其多蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)合功能相關(guān)的蛋白分子，形成多蛋白復合物，參與許多重要的細胞生理過程。既往的研究通過酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀和激光共聚焦等方法，在ECV-304細胞中證實了內(nèi)源性hCASK和Id1蛋白分子的相互作用：發(fā)現(xiàn)誘導表達hCASK的ECV-304細胞增殖緩慢，并且能誘導細胞周期相關(guān)蛋白p21、p16等表達上調(diào)，E蛋白家族成員(如E12、E417及HEB)參與了

6、這一信號調(diào)節(jié)過程，并由此提出hCASK-Id1通路抑制ECV-304細胞增殖的信號機制：hCASK通過與Id1結(jié)合，抑制Id1對bHLH轉(zhuǎn)錄因子的負調(diào)控作用，促進bHLH轉(zhuǎn)錄因子(如E蛋白家族的E12、E47和HEB)與p21啟動子E-box的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化p21等基因，抑制細胞G1/S期轉(zhuǎn)換，抑制細胞增殖。 本組研究發(fā)現(xiàn)，誘導表達hCASK可使p53表達升高，由于p53表達升高可通過調(diào)控細胞周期導致細胞增殖功能的抑制，因此hC

7、ASK-Id1信號通路是否可以通過調(diào)控p53的表達發(fā)揮細胞增殖抑制的功能值得進一步研究。 研究目的： 本研究的重點是考察hCASK-Id1信號通路調(diào)控細胞增殖的機制，探討hCASK-Id1通路是否可通過影響p53表達發(fā)揮其在細胞增殖調(diào)節(jié)中的調(diào)控作用，并初步探討該通路調(diào)節(jié)p53表達的機制。 研究方法： 1.采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)，應(yīng)用質(zhì)粒載體介導的細胞內(nèi)小干擾RNA(siRNA)表達策略，將針對CA

8、SK的RNA干擾質(zhì)粒pGenesil-1-hCASK轉(zhuǎn)染ECV-304細胞，篩選并建立CASK抑制表達細胞株，采用MTT、流式細胞技術(shù)和Western Blot印跡技術(shù)研究其對細胞增殖功能及p53表達的影響。 2.構(gòu)建Id1強制表達載體plRES2-EGFP-Id1，轉(zhuǎn)染ECV-304細胞，篩選并建立了Id1強制表達細胞株，用MTT、流式細胞技術(shù)和Western Blot印跡技術(shù)分析其對細胞增殖及p53表達的影響。 3.

9、構(gòu)建針對p53基因啟動子的熒光素酶報告基因載體，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含p53基因啟動子不同截短片段的載體，了解在p53基因啟動子上起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，為深入研究hCASK-Id1通路影響p53表達的信號機制提供信息。 結(jié)果： 1.RNA干擾對于hCASK的抑制率與其作用位點直接相關(guān)，本研究中2號靶點的抑制率約70％，而1號靶點幾乎沒有明顯的抑制效果。hCASK抑制表達可以使ECV-304細胞的生長曲線左移，促進細胞

10、增殖，細胞周期分析也發(fā)現(xiàn)抑制hCASK表達可導致細胞群中G2M+S期細胞比率升高，是細胞增殖能力增強的表現(xiàn)。 2.通過克隆Id1全長編碼基因，成功的構(gòu)建了Id1真核表達載體，轉(zhuǎn)染ECV-304細胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定Id1強制表達的細胞亞系。在所得到的ECV-304-Id1(+)細胞株中，轉(zhuǎn)染陽性細胞比率達到90％以上，為今后深入研究hCASK-Id1通路功能奠定了基礎(chǔ)。Id1的強制表達可以使細胞增殖曲線左移，細胞群中G2M

11、+S期細胞比率升高，促進細胞增殖。 3.Western Blot印跡實驗表明hCASK抑制表達和Id1強制表達均可使p53蛋白的表達下降。 4.成功構(gòu)建含p53基因啟動子的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，同未轉(zhuǎn)染ECV-304細胞相比，hCASK抑制表達細胞株和Id1強制表達細胞株都能使p53基因啟動子報告基因質(zhì)?；钚越档停崾緃CASK、Id1對p53表達的調(diào)節(jié)至少部分是通過影響p53基因轉(zhuǎn)錄水平造成的。 5.構(gòu)建了系列

12、截短的p53基因啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒。通過將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hCASK抑制表達和Id1強制表達細胞株，發(fā)現(xiàn)p53基因啟動子3’端約150bp的序列(從-150到-1)是激活p53基因表達必須的，在這段序列中，包含了E-box、Ets、AP-2、HIF-1、HES1、Sum1等潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。 6.將Id1強制表達和抑制表達質(zhì)粒與PGL3-p53p-luc共轉(zhuǎn)染己篩選出的CASK抑制表達細胞株，檢測Id1表達變化對p53

13、基因啟動子活性的影響，結(jié)果Id1抑制可使p53基因啟動子活性較hCASK抑制表達細胞株升高，而Id1強制表達可使hCASK抑制表達細胞p53基因啟動子的活性進一步下降。 結(jié)論： 1.hCASK抑制表達及Id1強制表達均可促進細胞增殖、下調(diào)p53蛋白表達。 2.hCASK-Id1通路對p53蛋白表達的調(diào)節(jié)至少部分是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮的，p53基因啟動子3’端約150bp的序列(從-150到-1)是激活p53基因表達必須