17β-群勃龍對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、群勃龍醋酸酯(17β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one17-acetate)是一種高效的甾類蛋白同化激素,它從20世紀(jì)70年代開(kāi)始便在美國(guó)被作為促生長(zhǎng)劑用于農(nóng)場(chǎng)牲畜。群勃龍醋酸酯在體內(nèi)釋放后,便在動(dòng)物血液中被迅速地水解成17β-群勃龍(17β-trenbolone,17β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one)。17β-群勃龍與雄激素有著類似的結(jié)構(gòu),且是一種有效的雄激素受體(AR)

2、激動(dòng)劑。人類與17β-群勃龍的可能接觸途徑有以下幾種:(1)有意注射。作為一種同化類雄激素類固醇,群勃龍被健身者作為用來(lái)增加肌肉和力量的藥品。在已經(jīng)發(fā)表的調(diào)查結(jié)果中,群勃龍是最受歡迎的注射藥物之一。多數(shù)注射者為業(yè)余健身愛(ài)好者,他們以較大的劑量長(zhǎng)期注射群勃龍。(2)食用肉殘留。(3)食物鏈富集。17β-群勃龍被牲畜和人排出體外后,飼養(yǎng)場(chǎng)的廢水、飼養(yǎng)場(chǎng)旁邊的河流以及城市污水排放的下游均可能被17β-群勃龍污染,而且飼養(yǎng)場(chǎng)的糞便常被用作農(nóng)田的

3、肥料。17β-群勃龍?jiān)诃h(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定,具有較長(zhǎng)的半衰期(在糞水中半衰期為260天)。17β-群勃龍可以進(jìn)入水生生物和植物體內(nèi),經(jīng)過(guò)食物鏈的層層累積,最終可能進(jìn)入到人體內(nèi)。(4)可能的臨床應(yīng)用。雖然17β-群勃龍與內(nèi)源雄激素睪酮(T)及二氫睪酮(DHT)結(jié)構(gòu)類似,但是其不能被5α-還原酶還原,也不能被芳香化,它所引起的雄激素樣和/或雌激素樣的副作用比一般的雄激素給藥產(chǎn)生的副作用要小,因此17β-群勃龍作為藥物與T及DHT相比有明顯的優(yōu)勢(shì)。

4、目前已有研究考慮將其應(yīng)用于臨床治療。
　　因?yàn)?7β-群勃龍是一種合成的雄激素,因此對(duì)其生殖毒性的研究一直都是熱點(diǎn),其它方面較少有人研究。目前的研究主要采用動(dòng)物模型研究17β-群勃龍的生殖毒性。17β-群勃龍的生殖毒性包括破壞下丘腦-垂體-性腺軸(HPG axis)、干擾動(dòng)物體內(nèi)源激素的水平及影響動(dòng)物生殖器官的發(fā)育和生殖能力。17β-群勃龍既會(huì)引起不同物種中雌性個(gè)體的雄性化,也可能會(huì)使發(fā)育中的雄性個(gè)體去雄性化。17β-群勃龍的神經(jīng)

5、毒性尚未見(jiàn)報(bào)道。在神經(jīng)退行性病變(如阿爾茨海默癥,AD)的發(fā)病機(jī)理中,除了遺傳因素,環(huán)境因素也起著至關(guān)重要的作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)是內(nèi)源雄激素的重要作用靶點(diǎn)之一,而17β-群勃龍作為一種合成雄激素也有可能作用于神經(jīng)系統(tǒng)。
　　本研究分別用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究17β-群勃龍的神經(jīng)毒性作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,將17β-群勃龍經(jīng)肌肉注射給正常成年Wistar大鼠及孕鼠,17β-群勃龍的注射劑量分別為0.2、1、5 mg/kg體重

6、,藥物處理時(shí)間為0.5、2、6、12、24、48 h。檢測(cè)大鼠腦組織、肌肉、血液及腦脊液(CSF)中17β-群勃龍的濃度及β-淀粉樣蛋白42(Aβ42)的水平,并分析大鼠血清激素水平的變化。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,研究了1-100nmol/L濃度的17β-群勃龍對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的影響,包括對(duì)其細(xì)胞活力、神經(jīng)元凋亡的影響,及對(duì)AD相關(guān)蛋白早老素-1(PS1)和Aβ42的影響,探索了AR和雌激素受體(ER)及基因組效應(yīng)和非基因組效應(yīng)在17

7、β-群勃龍的作用中所扮演的角色。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.17β-群勃龍可以穿過(guò)大鼠血腦屏障,聚集于大腦,尤其是海馬中。當(dāng)17β-群勃龍注射劑量分別為0.2、1、5mg/kg體重時(shí),在給藥48h后海馬中17β-群勃龍的濃度分別為:雄鼠5.42±0.27、6.12±0.21、7.03±0.17ng/g,雌鼠2.07±0.10、2.99±0.39、6.43±0.55ng/g。相對(duì)應(yīng)的除海馬外剩余腦組織中的17β-群勃龍濃

8、度分別為雄鼠2.64±0.25、2.85±0.30、4.44±0.24ng/g,雌鼠1.55±0.20、1.89±0.22、3.74±0.26ng/g。雄鼠三個(gè)劑量組及雌鼠最高劑量組(5 mg/kg體重)中的海馬中17β-群勃龍的濃度均顯著高于對(duì)應(yīng)的除海馬外剩余腦組織中的17β-群勃龍濃度。17β-群勃龍可以影響大鼠的血清激素水平,引起T、雌二醇(E2)及孕酮(PROG)水平的波動(dòng)。17β-群勃龍也可以穿過(guò)胎盤屏障,并可在胎鼠腦中檢出。

9、給予孕鼠注射5 mg/kg體重的群勃龍48h后,胎鼠腦中17β-群勃龍的濃度為2.59±0.21ng/g。17β-群勃龍可以引起雄性大鼠腦及海馬中Aβ42的過(guò)量積累,胎鼠腦中Aβ42也顯著增加。
　　2.為更好地研究17β-群勃龍對(duì)海馬損傷的機(jī)制,本研究采用原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)17β-群勃龍對(duì)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元有細(xì)胞毒性作用,可以引起細(xì)胞活力下降,引起其形態(tài)學(xué)改變、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成、磷脂酰

10、絲氨酸外翻、線粒體膜電位下降及caspase-3活力的增強(qiáng)。說(shuō)明17β-群勃龍可以引起海馬神經(jīng)元的凋亡。17β-群勃龍能夠抑制T對(duì)神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用。研究中采用不同的激動(dòng)劑和抑制劑處理,探究17β-群勃龍的細(xì)胞毒性作用機(jī)制。17β-群勃龍使原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元caspase-3活性及Aβ42產(chǎn)生增加,并引起PS1蛋白表達(dá)水平的下降,這三種過(guò)程均是AR和ER依賴性的,其作用過(guò)程同時(shí)有基因組效應(yīng)和非基因組效應(yīng)的參與。
　　大鼠血清激

11、素水平的改變表明其HPG axis可能受到影響。當(dāng)孕鼠接觸17β-群勃龍時(shí),子代個(gè)體的CNS在胎兒時(shí)期可能就已經(jīng)受到損傷。腦中Aβ42的增加將會(huì)影響胚胎CNS的正常發(fā)育及神經(jīng)元的正常功能。根據(jù)文獻(xiàn)中所提到的生殖毒性在子代出生后的發(fā)育過(guò)程中顯現(xiàn)出來(lái)的結(jié)果,CNS所受的損害可能是不可逆轉(zhuǎn)的。海馬在學(xué)習(xí)和記憶等行為中發(fā)揮著重要作用,17β-群勃龍?jiān)诤ｑR中的累積及其對(duì)海馬神經(jīng)元的細(xì)胞毒性作用可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果,如認(rèn)知障礙、記憶損傷等,這些癥狀

12、最后會(huì)引發(fā)癡呆。17β-群勃龍具有神經(jīng)毒性,可以引起海馬神經(jīng)元凋亡,影響AD相關(guān)蛋白Aβ42和PS1的表達(dá),它在神經(jīng)退行性病變中起到了一定
　　的作用。目前17β-群勃龍作為一種同化類雄激素類固醇被健身愛(ài)好者廣泛使用,其使用劑量、使用周期、使用時(shí)間長(zhǎng)短等應(yīng)當(dāng)受到監(jiān)管。另外,17β-群勃龍是一種環(huán)境雄激素,使除了健身愛(ài)好者之外的更多的人也處在暴露于17β-群勃龍的危險(xiǎn)中。神經(jīng)退行性病變(如AD)的發(fā)病是受基因因素和環(huán)境因素共同影響的

13、。目前大量的人力、物力、財(cái)力都放在了對(duì)基因因素的研究上,但是相當(dāng)多的AD病人并沒(méi)有攜帶如PS1、APP等的突變基因,因此環(huán)境因素在AD的發(fā)病中扮演著重要的角色。因?yàn)镃NS是激素作用的重要靶點(diǎn)之一,因此該研究的意義不只在于對(duì)17β-群勃龍毒性作用的發(fā)現(xiàn)。環(huán)境激素在我們的生存環(huán)境中無(wú)處不在,它們有著與人體內(nèi)源激素相似的結(jié)構(gòu)和/或性質(zhì),因此它們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響值得關(guān)注。發(fā)現(xiàn)這些危險(xiǎn)因素并采取預(yù)防措施,將對(duì)延緩神經(jīng)退行性病變有重要意義。

14、　　本文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):
　　1.給成年大鼠肌肉注射17β-群勃龍后,17β-群勃龍會(huì)分布于腦中,尤其是海馬中。給孕鼠注射后,可以在胎鼠腦中檢出17β-群勃龍。神經(jīng)組織是17β-群勃龍的一個(gè)作用靶點(diǎn)。
　　2.17β-群勃龍有神經(jīng)毒性,會(huì)引起原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元凋亡,引起AD相關(guān)蛋白Aβ42和PS1的表達(dá)水平變化。由神經(jīng)元產(chǎn)生的Aβ42的增加,而PS1的蛋白表達(dá)水平下降,并且這些過(guò)程由激素受體介導(dǎo)。
　　3.17β-群勃龍