念珠菌與新型隱球菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立.pdf

1、目的:
　　旨在建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR）檢測(cè)體系，以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、特異、定量地檢測(cè)包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌以及新型隱球菌在內(nèi)的臨床侵襲性真菌感染常見(jiàn)的病原菌，為臨床醫(yī)生對(duì)該疾病的診斷、治療提供指導(dǎo)。
　　方法:
　　于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)、中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(A

2、CCC)購(gòu)買(mǎi)真菌標(biāo)準(zhǔn)株，培養(yǎng)后制成濃度約為107CFU/ml真菌標(biāo)準(zhǔn)株混懸液，10倍梯度稀釋成107~100CFU/ml，用于真菌實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（FQ-PCR）檢測(cè)體系的建立。在基因庫(kù)(NCBI)中分別下載多種真菌、細(xì)菌、病毒以及人類(lèi)基因序列，通過(guò)比對(duì)找出五種真菌：白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和新型隱球菌各自的特異性區(qū)域，利用Primer Premier5.0和Beacon Designer7.7設(shè)計(jì)引物探針。

3、通過(guò)對(duì)比一步裂解法、Lyticase酶消化法、玻璃珠破壁法、Biospin膜吸附法、磁珠法、濃縮裂解法、濃縮裂解結(jié)合加熱等方法提取真菌DNA的效率及擴(kuò)增效果，尋找真菌DNA提取的最佳方法。同時(shí)通過(guò)對(duì)Mg2+、dNTP、引物及探針濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出各自的最佳反應(yīng)體系，并驗(yàn)證反應(yīng)體系的特異性、重復(fù)性，并分析各自反應(yīng)的靈敏度，對(duì)臨床分離出的86例真菌病原菌進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　成功設(shè)計(jì)白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念

4、珠菌、光滑念珠菌和新型隱球菌的特異性引物探針，念珠菌及新型隱球菌的DNA提取效率以及熒光定量PCR效果以濃縮裂解結(jié)合加熱的方法最佳，擴(kuò)增曲線呈典型“S”形。在最佳反應(yīng)體系下，五種真菌的PCR反應(yīng)體系均能分別對(duì)各自對(duì)應(yīng)的真菌進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而與其他真菌、細(xì)菌、病毒以及人類(lèi)基因組之間無(wú)交叉反應(yīng)。每一個(gè)反應(yīng)體系不同底物濃度與Ct值之間成良好的線性關(guān)系，R2均在0.995以上。白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌以及新型隱球菌反應(yīng)體系檢測(cè)的靈敏

5、度為5CFU/ml，熱帶念珠菌靈敏度為50CFU/ml，所有反應(yīng)體系穩(wěn)定性、重復(fù)性好，批內(nèi)、批間重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，所得每一種反應(yīng)體系Ct值批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于5％（在0.22%至3.19%之間）。所建立的5種反應(yīng)體系對(duì)臨床分離菌株檢測(cè)的結(jié)果陽(yáng)性率為100%，并且無(wú)交叉反應(yīng)發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　濃縮裂解結(jié)合加熱法是適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的成功、高效的真菌DNA提取方法。成功設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念