HBsAg-CT MOMP重疊表位的克隆及鑒定.pdf

1、目的:
　　1.篩選、鑒定沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)主要外膜蛋白(Major OuterMembrane Protein，MOMP)B、CTL細(xì)胞表位，選擇富含B表位和CTL表位的肽段為重疊表位疫苗研究提供理論依據(jù)。
　　2.合成酵母密碼子優(yōu)化的乙肝表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)基因，構(gòu)建PPIC9K/HBsAg△重組質(zhì)粒(HBs

2、Ag△表示酵母優(yōu)化的HBsAg)，作為呈遞B、CTL細(xì)胞重疊表位的載體。
　　3.構(gòu)建Ct重疊表位的PPIC9K/HBsAg△/Ct MOMP重組質(zhì)粒，并通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該融合蛋白，為后續(xù)的免疫效應(yīng)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.以E型Ct標(biāo)準(zhǔn)株MOMP的完整氨基酸序列為基礎(chǔ)，應(yīng)用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)，預(yù)測(cè)MOMP的HLA-A*0201限制性CTL表

3、位，選擇分值較高的肽段，采用肽親和實(shí)驗(yàn)、胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)及細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)分析預(yù)測(cè)所得CTL表位。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道的B細(xì)胞表位[1-2]，綜合分析后選擇同時(shí)含B細(xì)胞表位及CTL細(xì)胞表位的肽段作為重疊表位的候選區(qū)。
　　2.采用酵母密碼子優(yōu)化策略，通過(guò)不對(duì)稱PCR方法得到HBsAg片段，并克隆至酵母表達(dá)載體PPIC9K中，獲得PPIC9K/HBsAg△重組質(zhì)粒，同時(shí)利用PCR從乙肝患者血清中擴(kuò)出HBsAg（野生型）作為對(duì)照。構(gòu)建的PP

4、IC9K/ HBsAg重組質(zhì)粒（包括密碼子優(yōu)化和野生型的HBsAg）經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序分析鑒定。
　　3.將Ct MOMP重疊表位克隆入PPIC9K/HBsAg△重組質(zhì)粒，構(gòu)建成嵌合重組質(zhì)粒PPIC9K/HBsAg△/MOMP重疊表位，并PCR、酶切和測(cè)序分析鑒定。目前，正在進(jìn)行電轉(zhuǎn)畢赤酵母GS115，經(jīng)G418和組氨酸(His)篩選高拷貝菌株，甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，并擬采用SDS-PAGE電泳和Western blot分析鑒

5、定，及通過(guò)電鏡觀察HBsAg△/MOMP重疊表位病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLP)的形成。
　　結(jié)果:
　　1.CTL表位的預(yù)測(cè)結(jié)合肽親和實(shí)驗(yàn)、胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)及細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果，MOMP第73～81區(qū)段、第160～169區(qū)段、第217～225和第378～387區(qū)段為抗原特異性、MHC限制性殺傷的CTL表位。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道的B細(xì)胞表位[1-2]，故選擇第217～225和第378～387區(qū)段

6、作為目的研究片段。
　　2.通過(guò)不對(duì)稱PCR獲得了HBsAg△片段，成功構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K/HBsAg△，并從血清中擴(kuò)出HBsAg野生型片段，成功構(gòu)建了PPIC9K/HBsAg（野生型）對(duì)照質(zhì)粒。
　　3.構(gòu)建了HBsAg△/MOMP嵌合基因，并成功克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K中，構(gòu)建了兩個(gè)含有Ct MOMP重疊表位的酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K/HBsAg△/MOMP217-225，PPIC9K/HBsAg△/M

7、OMP378-387。并轉(zhuǎn)化酵母GS115，重組子鑒定顯示轉(zhuǎn)化成功。
　　結(jié)論:
　　1.經(jīng)預(yù)測(cè)鑒定篩選了兩個(gè)較好的Ct MOMP重疊表位。
　　2.通過(guò)分子克隆成功構(gòu)建了PPIC9K/HBsAg△和PPIC9K/HBsAg（野生型）兩個(gè)酵母表達(dá)質(zhì)粒。
　　3.通過(guò)分子克隆成功構(gòu)建了2個(gè)含重疊表位的重組質(zhì)粒PPIC9K/HBsAg△/MOMP217-225和PPIC9K/HBsAg△/MOMP378-387，并轉(zhuǎn)