SARS冠狀病毒N蛋白單克隆抗體的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorySyndrome，SARS)是一種以發(fā)熱和嚴(yán)重肺部感染為主要特征的新發(fā)急性傳染病。2003年4月16日，WHO正式宣布：SARS的病原體是一種新型冠狀病毒，并命名為SARS冠狀病毒(SARS-CoV)。研究表明，SARS-CoV與人類普遍易感的冠狀病毒OC43株和229E株無(wú)抗體交叉反應(yīng)，是一種新的從未在人類或動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)過(guò)的冠狀病毒。盡管目前SARS的流行已經(jīng)得到控制，但迄

2、今為止，SARS的起源、動(dòng)物宿主、傳播途徑及致病機(jī)理等仍不完全清楚，SARS對(duì)人類的威脅依然存在。由于從臨床癥狀及其發(fā)病體征很難與其它病原體引起的發(fā)熱性呼吸系統(tǒng)疾病區(qū)分，所以早期特異實(shí)驗(yàn)診斷顯得更加重要。 本實(shí)驗(yàn)利用基因工程表達(dá)的重組SARS冠狀病毒N蛋白免疫2月齡的BALB/c小鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，建立了10株能穩(wěn)定分泌SARS冠狀病毒N蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過(guò)制備腹水，對(duì)

3、這些單克隆抗體進(jìn)行純化、分析和鑒定。 對(duì)這些單克隆抗體進(jìn)行了如下的免疫學(xué)鑒定：①效價(jià)測(cè)定：10株單克隆抗體中，除7＃腹水效價(jià)稍低一些為1∶104外，其他腹水效價(jià)均在1∶107～1∶108之間，顯示出這些單抗都有較高的抗SARS冠狀病毒N蛋白活性。②免疫球蛋白類型及其亞類特異性鑒定：采用雙向瓊脂擴(kuò)散和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)鑒定10株單克隆抗體，結(jié)果表明該10株抗N蛋白抗原的單克隆抗體都為IgG類型，IgG1亞類。③親和力分析：利用抗體稀

4、釋法，對(duì)10株單克隆抗體的親和力進(jìn)行分析，結(jié)果表明：a＃、b＃、c＃號(hào)單抗與N蛋白的親和力最高，其親和常數(shù)分別為：1.50×109L/mol、7.50×108L/mol、1.05×109L/mol；d＃、1＃、2＃、4＃、5＃次之，其親和常數(shù)分別為：3.75×108L/mol、3.00×108L/mol、3.00×108L/mol、1.80×108L/mol、1.80×108L/mol；3＃、7＃與N蛋白的親和力最低，其親和常數(shù)分別為：

5、4.39×106L/mol、6.00×106L/mol。④配對(duì)組合：利用制備的單克隆抗體，通過(guò)對(duì)各株單克隆抗體特性和捕捉SARS冠狀病毒N蛋白能力的比較以及單抗初步配對(duì)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有三組組合可以配對(duì)：a＃和a＃-HRP、1＃和d＃-HRP、a＃和4＃-HRP，其中以a＃單抗作為包被抗體，4＃單抗標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)作為標(biāo)記抗體為最佳配對(duì)組合，由此建立了單克隆抗體夾心法ELISA特異檢測(cè)SARS冠狀病毒抗原的方法。初步試驗(yàn)結(jié)果證明，

6、所建立的單克隆抗體夾心ELISA檢測(cè)方法具有較好的特異性和靈敏度，靈敏度達(dá)到5ng/ml，通過(guò)進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，有望更好地用于SARS病毒感染的特異診斷。 通過(guò)系統(tǒng)鑒定，證明這些單克隆抗體針對(duì)冠狀病毒N蛋白的不同抗原決定簇，具有較高的特異性，不僅為開發(fā)SARS病毒早期診斷(抗原診斷)試劑的研究提供了單抗支持，而且解決了抗體檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照無(wú)害化的問(wèn)題，同時(shí)對(duì)于SARS-CoV保護(hù)性抗原研究、SARS免疫學(xué)和發(fā)病機(jī)制的研究提供了有力