OGT供體底物識別機制及其自身O-GlcNAc糖基化修飾功能的研究.pdf

1、O-GlcNAc糖基化修飾是一種動態(tài)的蛋白質翻譯后修飾，廣泛存在于植物和動物中，能夠影響蛋白的催化活性、亞細胞定位以及與其他蛋白之間的相互作用，參與細胞內的信號轉導、能量代謝等重要的細胞生理活動，與多種慢性疾病相關。
　　O-GlcNAc糖基轉移酶(OGT)負責催化O-GlcNAc糖基轉移反應的發(fā)生。在人體內，OGT有三種亞型，即ncOGT、mOGT和sOGT，其結構的主要差異在于N末端TPR序列數(shù)目不同。由于三種亞型C末端催化結

2、構域是完全相同的，因此其催化機制以及其與糖基供體的識別機制也應是相同的。因此在本課題中，我們選取了較為容易表達的sOGT作為研究對象，首先對其底物特異性進行了研究。以CK(II)十七肽為受體底物，我們探索sOGT對26種UDP-GlcNAc衍生物的催化活性。其中，UDP-6-deoxy-GlcNAc、UDP-GlcNPr、UDP-6-deoxy-GalNAc和UDP-4-deoxy-GlcNAc四種化合物能夠作為sOGT的供體底物。進一

3、步對其中三種化合物的酶學常數(shù)的測定表明，UDP-GlcNAc糖基基團的C2位乙酰氨基上的取代、C6和C4位羥基的脫氧取代以及C4位羥基的異構都會削弱sOGT與供體底物的親合力。通過OGT與底物的分子對接，并經(jīng)定點突變驗證，我們發(fā)現(xiàn)sOGT的Leu653的羰基氧和Thr560位的羥基能夠與GlcNAc的C4/C6-OH形成氫鍵;Met501與UDP-GlcNAc的C2位乙酰氨基間的空間較小，不能容納體積較大的取代基團，而其附近的疏水環(huán)境也

4、利于疏水性取代基團的進入。上述結論為進一步了解OGT與糖基供體的相互作用以及其催化機制有一定幫助。
　　已有研究表明，OGT也可以作為自身催化O-GlcNAc糖基轉移反應的底物，被糖基化修飾?；贠-GlcNAc修飾的功能，我們認為OGT的自身糖基化參與了對OGT功能的調控。
　　本課題運用多種生物學和化學研究方法對OGT的自身糖基化修飾現(xiàn)象進行了研究，發(fā)現(xiàn)了6個糖基化位點(S10，T12，S18，T38，S52，T449，

5、T662)，定點突變結果證實其中三個糖基化位點(S18，T38，T449)對sOGT糖基化水平有顯著影響。通過對過表達的sOGT在細胞質和細胞核的分布及糖基化水平的研究發(fā)現(xiàn)，細胞質內sOGT的糖基化水平更高。通過激光共聚焦顯微鏡對不同sOGT突變體的亞細胞定位進行觀察，與野生型相比較，發(fā)現(xiàn)T449A和T662A兩個突變體轉運入核明顯減少，而其它突變體變化不大，這表明T449和T662兩個位點可能與sOGT轉運入核相關。通過Pull do