水稻矮化劍葉卷曲基因DCFL1的圖位克隆和功能研究.pdf

1、株高是水稻最重要的農藝性狀之一，直接影響水稻的抗倒伏和產量，大量矮桿突變體的出現引發(fā)了“第二次綠色革命”。劍葉是水稻最重要的功能葉，其形態(tài)特征關系到葉片間的通透性和光能利用率，直接影響水稻灌漿速度和籽粒飽滿度。因此，了解水稻株高的遺傳模式和劍葉發(fā)育的分子機理對水稻株型改良和豐產具有極其重要的意義。利用EMS誘變秈型水稻恢復系縉恢10號，從其后代鑒定到一個矮化劍葉基部特異卷曲突變體，暫命名為dcfl1(dwarf and curled f

2、lag leaf1)。本文對dcfl1進行了表型和細胞學觀察，光合色素含量和光合參數分析，并開展了基因定位、圖位克隆、表達模式分析和功能驗證等研究。主要結果如下：
　　1. dcfl1的表型分析和農藝性狀調查
　　突變體dcfl1全生育期表現出矮化性狀，dcfl1的細胞長度明顯比野生型短，達到了極顯著水平，而細胞寬度無顯著差異。抽穗期dcfl1劍葉的葉片和葉鞘連接處硬化，劍葉基部展開受阻，半邊葉片向內卷曲。劍葉上部和中部正常

3、，其他葉片也正常。農藝性狀分析發(fā)現，與野生型相比，dcfl1的有效穗數為14.2，極顯著高于野生型的11.6，穗粒數、實粒數、結實率和千粒重等則無顯著變化。
　　2. dcfl1的光合色素含量和光合參數測定
　　開花期對光合色素含量測定結果顯示，dcfl1的劍葉、倒2葉和倒3葉的葉綠素 a含量均極顯著高于野生型，類胡蘿卜素含量也略有升高，但僅劍葉達到極顯著差異水平，葉綠素 b含量則無顯著變化。光合參數測定發(fā)現，與野生型相比，

4、 dcfl1的胞間CO2濃度無明顯變化，凈光合速率Pn、氣孔導度Gs和蒸騰速率Tr則顯著降低。
　　3. dcfl1的遺傳分析與基因定位
　　利用雜交組合西農1A/dcfl1的 F1、F2群體進行遺傳分析，表明dcfl1突變表型受1對隱性核基因控制。以西農1A/dcfl1雜交組合的620株F2隱性單株為定位群體，利用SSR標記和InDel標記進行基因定位，最終將DCFL1定位在第3染色體Ind03-11和Ind03-6之間，

5、物理距離約為78kb。
　　4. DCFL1基因的克隆與蛋白分析
　　對定位區(qū)間內的15個注釋基因進行基因測序，發(fā)現LOC_Os03g04680在dcfl1中發(fā)生了一個G-A的堿基替換，導致編碼的氨基酸從半胱氨酸變成了酪氨酸，初步確定為DCFL1的候選基因。DCFL1編碼細胞色素P450加單氧酶OsCYP96B4，屬于CYP86家族中的CYP96亞家族。
　　5. DCFL1候選基因的確定
　　利用野生型DCFL

6、1基因組片段包括上游2875bp、編碼框和下游1315bp構建互補表達載體，通過農桿菌介導遺傳轉化突變體 dcfl1。在轉基因植株中，我們共鑒定了12株陽性轉基因植株，表型觀察發(fā)現突變體表型得以恢復，確定了LOC_Os03g04680是DCFL1基因。
　　6. DCFL1基因的表達模式分析
　　通過半定量RT-PCR和qPCR等技術進行表達模式分析，結果表明DCFL1在根、莖、葉和穗中都有表達；在葉片和葉鞘中表達量較高，其

7、中，劍葉葉鞘表達量最高。利用 GUS試驗進一步探究 DCFL1基因表達模式。GUS染色結果表明DCFL1基因在各器官均有表達，這與半定量RT-PCR和qPCR結果一致。
　　7. DCFL1基因與激素的關系
　　激素處理實驗發(fā)現不同濃度的BR和GA3均無法使突變體dcfl1和等位突變體dcfl1-1矮化表型得以恢復。說明兩個突變體的矮化表型不受外源BR和GA3的影響，但在沒有驗證其他植物激素的響應以及沒有檢測突變體 dcfl

8、1和突變體dcfl1-1內源激素的前提下，不能排除DCFL1參與植物激素代謝途徑的可能性。
　　8. DCFL1基因可能參與表皮蠟質的合成
　　對突變體 dcfl1卷曲的劍葉基部表皮進行掃描電鏡觀察發(fā)現 dcfl1的兩個小葉脈之間存在溝壑，導致dcfl1表皮蠟質覆蓋面積減少。葉綠素浸析試驗結果發(fā)現dcfl1的表皮滲透性升高，導致葉綠素比野生型更容易提取出來，暗示著dcfl1表皮蠟質含量要低于野生型。這些結果表明DCFL1可能