精索靜脈曲張對睪丸超微結構和精子形態(tài)、功能影響的實驗研究.pdf

1、目的:精索靜脈曲張是青壯年男性中的常見病及多發(fā)病,是由于精索靜脈血液回流受阻或靜脈瓣膜功能失效而導致精索靜脈迂曲擴張所致。精索靜脈曲張好發(fā)于左側,是由于左側精索靜脈是以直角注入左腎靜脈,而右側精索靜脈是以斜角注入下腔靜脈等解剖結構原因造成的。WHO將精索靜脈曲張列為青壯年男性不育原因的第一位,可見精索靜脈曲張在男性不育中的重要地位。目前研究表明精索靜脈曲張致男性不育涉及到免疫、內分泌、細胞凋亡、血液反流、溫度變化及感染等多方面原因,但均

2、不能完全解釋其發(fā)病機制。本研究通過實驗性精索靜脈曲張動物模型的建立,在透射電鏡下觀察睪丸生精細胞、間質細胞、支持細胞的超微結構,利用計算機輔助精液分析(CASA)系統(tǒng)研究精子運動能力及形態(tài),來揭示精索靜脈曲張導致男性不育的機理,為臨床精索靜脈曲張的研究和治療提供參考。
　　 方法:
　　 1動物分組:選擇鼠齡(50±10)天(青春期),體重240～280g的SD(Sprayue-Dawley)三級雄性大鼠40只,將大鼠隨

3、機分為精索靜脈曲張組(實驗組)20只,假手術組(對照組)20只,所有大鼠在同等條件下飼養(yǎng)12周,自由飲食、飲水。
　　 2模型的建立:精索靜脈曲張動物模型按Turner法建立,用10％水合氯醛(3.33 ml/kg)腹腔注射麻醉,固定后取上腹正中切口,打開腹腔后,將左腎周圍的內臟組織移到右側,使左側腎臟及左腎靜脈完全暴露,在左腎至下腔靜脈間完全分離出左腎靜脈,于左腎上腺靜脈與下腔靜脈之間置-8號注射器的針頭(直徑約0.8mm),

4、在左腎靜脈與下腔靜脈交叉處用3-0的絲線將針頭與左腎靜脈一同結扎,這樣大約就能使左腎靜脈直徑縮小一半,然后抽出針頭,可見到左腎靜脈擴張充血,用生理鹽水沖洗腹腔后4-0的絲線依次縫合切口;假手術組完全顯露出左腎靜脈后只穿線打結,而不縮窄左腎靜脈,余步驟同手術組。術后連續(xù)三天腹腔注射青霉素(20萬單位1/日),術后第12周將兩組大鼠分別脫頸處死,如果手術組左側精索靜脈直徑大于1mm,并且左右兩側腎臟重量無明顯差別表示動物模型建立成功。

5、>　　 3睪丸電鏡標本的采集及觀察:手術摘取兩組動物左側睪丸后,立即切取約1mm3大小睪丸組織放入含2％戊二醛和1％多聚甲醛混合液中,在混合液中固定24小時后,立即用pH值為7.4的PBS液漂洗12小時,然后將標本放入1％四氧化鋨酸液中再固定2小時,再次用pH值為7.4的PBS液漂洗,隨后用梯度乙醇將標本脫水,再用環(huán)氧樹脂將其包埋,制作成超薄切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色后,以HITACHI-H7500型透射電鏡觀察睪丸的超微結構。

6、
　　 4精液標本的采集及檢測:脫頸處死大鼠后,立即摘取兩組動物的附睪,并剔除掉附睪周圍的脂肪組織,用PBS液洗凈后,切下附睪的尾部,然后用眼科剪在其尾部切開三個縱行的裂口,立即放入2ml的離心管中,將PBS液加至2ml,然后將離心管放入37℃水浴箱中,讓精子自由游出,水浴20分鐘后將離心管取出。
　　 4.1用微量移液器吸取10μl上層的精液懸液,采用計算機輔助精液分析(CASA)系統(tǒng)進行精子運動能力的檢測。觀察參數(shù)為

7、:精子密度(p),精子活率(MOT),直線運動精子密度,直線運動精子活率,路徑速度(VAP),a級快速向前運動,b級快速向前運動,曲線速度(VCL),直線速度(VSL),鞭打頻率(BCF),平均移動角度(MAD),線性度(LIN),前向性(STR),擺動性(WOB),側擺幅值(ALH)。4.2用可調節(jié)加樣器吸取40μl精子懸液滴在載玻片上,然后用加樣吸頭側向輕輕將懸液推開,讓其自然晾干,用甲醇固定10min后,再自然晾干,然后將載玻片放

8、入含有1％伊紅染液的染色缸中染色,染色1.5小時后將載玻片取出并用自來水沖洗,自然晾干(每個精液標本制片2張),最后,在光學顯微鏡下觀察精子的形態(tài),計算精子畸形率。
　　 所有數(shù)據(jù)用((x-)±s)表示,兩組間差異比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析,檢驗水準為a=0.05或a=0.01。
　　 結果:
　　 1電鏡觀察的結果:實驗組與對照組相比較,支持細胞基膜水腫,細胞間大部

9、分融合,Sertoli-Sertoli細胞連接模糊不清或者斷裂,胞質內線粒體及滑面內質網(wǎng)的數(shù)量明顯減少,可見大量的溶酶體顆粒;間質細胞表面的微絨毛,胞質內的線粒體及滑面內質網(wǎng)數(shù)量均明顯較少,胞質內可見大量的溶酶體顆粒,較大的空泡,凋亡細胞增加,染色質固縮:精子細胞核畸形,核內可見大量的空泡、核膜消失,頂體消失或為小頂體,染色質過度濃縮。
　　 2精液分析的結果:實驗組與對照組相比較,精子活率(MOT)、前向性(STR)的值降低,

10、兩組之間存在顯著性差異(P＜0.05);精子密度(p)、直線運動精子密度、直線運動精子活率、路徑速度(VAP)、a級快速前向運動、b級快速前向運動、曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、側擺幅度(ALH)值明顯降低,而畸形率顯著增加,兩組之間比較具有顯著性(P＜0.01);精子平均移動角度(MAD)、線性度(LIN)、擺動性(WPB)、鞭打頻率(BCF)的值無明顯變化,兩組之間比較無差異性(P＞0.05)。
　　 結論: