黃芩及同屬混淆品種子的系統(tǒng)鑒別研究.pdf

1、黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，此外，在實際應用中還存在一些地方代用品與混淆品，河北省為黃芩主產區(qū)，同時大量分布有粘毛黃芩ScutellariaviscidulaBge.，并頭黃芩ScutellariascordifoliaFischexSchrank，沙灘黃芩ScutellariastrigillosaHemsl，北京黃芩ScutellariapekinensisMaxim等多種同

2、屬植物。近年來，主產地栽培黃芩逐步成為主要商品來源，但是，種子市場基源品種混亂，僅憑感官識別，同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴重。幾種黃芩屬植物的種子在外部形態(tài)上非常相近，難以宏觀鑒別，為確保黃芩藥材質量的穩(wěn)定可控，在規(guī)模化、規(guī)范化種植中首先要保證黃芩種源純化、優(yōu)良。本實驗從外觀性狀、顯微特征、理化性質等方面，并利用細胞生物學、分子生物學技術及超微技術對黃芩屬幾種植物的種子進行綜合鑒別研究。既有快速、簡便、實用、滿足基層需要的方法又有新技術與傳

3、統(tǒng)中藥鑒定技術交叉融合的深層次鑒別研究，也是我省制定中藥種子標準前重要的應用基礎研究。 一、性狀、顯微、理化鑒別 目的：應用快速、簡便、實用的方法，建立黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩、并頭黃芩、北京黃芩種子的外觀性狀、顯微特征、超微特征、理化性質方面的綜合鑒別信息指征。 方法：1.外觀性狀觀察。2.脫色表面片制備：(1)脫色：取種皮切成l-2mm小塊浸入水合氯醛溶液中。(2)壓片觀察。3.石蠟橫切片制備：(1)取材和

4、固定：種子用蒸餾水4℃浸泡一周以上，F(xiàn).A.A固定液固定一周以上。(2)脫水：依次用濃度為70％、80％、90％、95％的乙醇溶液、無水乙醇進行脫水，每隔2-3h調換溶液。(3)透明：二甲苯一無水乙醇(1：1)浸種1h后，轉入二甲苯中至種子透明為止。(4)浸蠟：65℃恒溫箱中進行，半小時調蠟一次，至種子完全浸透。(5)包埋和切片：石蠟包埋，切片厚度12μm。(6)貼片和融蠟。(7)染色：番紅一固綠雙重染色。(8)脫水與封藏。4.種皮掃描

5、電鏡觀察(1)清洗：取種子用50％乙醇超聲清洗5min。(2)脫水：50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇逐級脫水，每一級脫水兩次，每次30min，其間不斷震蕩清洗。(3)固定：戊二醛固定30min。(4)電鏡觀察：真空噴金后，進行觀察。5.紫外掃描圖譜特征：(1)取一定量黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩和并頭黃芩種子粉末用石油醚索氏提取3h，制備供試液A；揮干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3h，制備供試液B；然后揮干乙酸乙酯用甲醇索氏

6、提取3h，制備供試液C。(2)掃描波長為200-400nm的紫外吸收圖譜。(3)圖譜分析。7.薄層色譜鑒別：(1)取一定量黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩和并頭黃芩種子粉末用石油醚索氏提取3h制備供試液D，供點樣；另取種子粉末適量用70％乙醇超聲提取制備供試液E。(2)點樣，展開。(3)顯色、觀察、照相。 結果：1.宏觀性狀：五種種子均為近球形，黃芩和粘毛黃芩種子稍大，顏色為棕黑色，其余三種黃芩種子稍小，顏色稍淺，整體性狀相似不易區(qū)分。

7、2.脫色表面片：幾種種子在內外表面細胞形狀、細胞壁增厚和內含物方面有一定的區(qū)別。3.石蠟橫切片：幾種種子在表面凸起，果皮細胞層數(shù)、形狀和表面角質層次級凸起特征上都有明顯差別。4.掃描電鏡觀察：幾種種子的次級凸起的微觀特征明顯差別。5.紫外掃描圖譜：乙酸乙酯和甲醇提取部分的吸收峰數(shù)目和吸收峰位置有一定差別。7.薄層色譜：幾種供試液黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩和并頭黃芩種子的薄層色譜有一定差別，可用于鑒別。 結論：黃芩及其同屬植物的種子

8、在外觀性狀、顯微特征、理化性質存在差異，由此可以用于鑒別。方法快速、簡便、實用，適用于幾種種子的快速鑒別。 二、細胞生物學及分子生物學特征研究 目的：利用染色體組型分析、種子蛋白質PAGE技術及RAPD技術研究藥用黃芩品種之間及黃芩屬幾種植物的綜合鑒別信息指征，從細胞水平及分子水平鑒別真?zhèn)?，并為黃芩的品種篩選提供依據。 方法：1.根尖體細胞染色體標本片制備：(1)預處理：種子25℃下萌發(fā)，根尖長1-2cm時切取，

9、蒸餾水0-3℃處理24h。(2)固定：卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸3∶1)固定。(3)解離：95％乙醇∶濃鹽酸(1∶1)解離5-10min。(4)后低滲：重蒸水低滲，時間8-15min。(5)染色：改良石炭酸品紅液染色。(6)封片：冰凍揭蓋片，中性樹膠封片。(7)顯微照相、計數(shù)、測量。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)圖譜特征研究：(1)制備供試品溶液。(2)制備分離膠和濃縮膠。(3)電泳：恒定電壓120-180V。(4)染色和洗脫：考

10、馬斯亮藍(R-250)染色，脫色液洗脫至背景清晰為止。(5)結果分析：繪圖并測定特征譜帶泳動率。3.RAPD技術鑒別：(1)高鹽低pH法提取純化植物總DNA。 (2)PCR擴增及引物篩選。(3)圖譜分析。 結果： 1.根尖體細胞染色體組型特征：黃芩染色體2n=18，染色體總長度48.9μm，平均長度2.7μm，變異倍數(shù)為2.05；粘毛黃芩染色體總數(shù)為2n=18，染色體總長度53μm，平均長度2.95μm，變異倍數(shù)

11、為2.44。 2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)圖譜特征：黃芩、粘毛黃芩和沙灘黃芩種子的譜帶數(shù)目和位置不同。黃芩圖譜中一級帶6條，二級帶1條；粘毛黃芩圖譜中一級帶1條，二級帶4條，三級帶2條；沙灘黃芩圖譜中一級帶1條，二級帶2條，三級帶4條。幾種黃芩之間有明顯差別。 3.RAPD鑒別研究：篩選出可對黃芩、粘毛黃芩、沙灘黃芩進行有效擴增的引物11條，在擴增條帶數(shù)目和位置上有明顯差異，可用于鑒別。 結論：應用分子生物