豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2主要抗原位點區(qū)的表達及抗體檢測方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種以后備母豬流產(chǎn)以及新生仔豬嚴重肺炎為特征的重要傳染病，致病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，是一種正鏈RNA病毒。非結(jié)構(gòu)蛋白2(NSP2)是PRRSV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，可分為四個功能區(qū)，中間的高變區(qū)是富含B細胞表位的區(qū)域，有研究表明缺失高變區(qū)的部分B細胞表位對PRRSV的復制能力并無影響，因而，可以通過缺失這些區(qū)域制備表位缺失標記病毒疫苗，為PRRSV感染動物與免疫動物鑒別診斷提供依據(jù)。本研

2、究表達了兩種PRRSV GSWW毒株的NSP2主要抗原表位區(qū)蛋白，以其中一種純化的重組蛋白為抗原，初步建立了檢測PRRSV血清抗體的間接ELISA方法;并利用另一種分子量較大的表達蛋白研制NSP2單克隆抗體，為建立表位缺失標記病毒疫苗的配套診斷方法奠定基礎(chǔ)。
　　以克隆獲得的PRRSV/GSWW/15毒株的NSP2基因為模板，設計特異性PCR擴增引物，擴增獲得750 bp的NSP2第2010-2759 bp區(qū)域（命名為EF2），將

3、EF2片段亞克隆入pET-28a表達載體;同時，委托公司合成了NSP2第2226-3110 bp片段（命名為GD2），并將其亞克隆入表達載體pET-30a，重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，分別表達獲得了大小為29 ku、47 ku的EF2和GD2重組蛋白;免疫印跡結(jié)果證實表達的蛋白能被PRRSV陽性血清識別，具有良好的反應活性。
　　以純化復性后的EF2重組蛋白包被酶標板，初步建立了檢測PRRSV NSP2抗體的間接ELISA方法，該間

4、接ELISA方法的主要參數(shù)為最佳抗原包被濃度1μg/mL，最佳血清稀釋度1∶20，兔抗豬IgG酶標二抗體稀釋度1∶2000。通過檢測30份健康豬血清，確定了間接ELISA方法的判定標準為:S/P＞0.17，為PRRSV NSP2抗體陽性;S/P≤0.17，為PRRSV陰性。以此判定標準，檢測豬瘟病毒陽性血清、豬偽狂犬病毒陽性血清、口蹄疫病毒陽性血清各1份均為陰性，檢測30份PRRSV非免疫健康豬血清，均為陰性;檢測133份PRRSV感染

5、后PPRSV豬血清，敏感性為88.7％，表明該方法具有良好的特異性與敏感性。方法重復性檢測，批內(nèi)變異系數(shù)為3.8％～6.8％;批間變異系數(shù)為4％～8.6％，具有很好的重復性。與法國LSI商品化試劑盒對比，符合率為73.1％;與北京世紀元亨試劑盒相比，符合率為77.2％。結(jié)果表明，所建立的ELISA方法可用做PRRSV抗體的臨床檢測。
　　利用表達純化的GD2蛋白免疫小鼠，制備了9株NSP2的單克隆抗體，疊加ELISA試驗證明，9株