熒光定量PCR法檢測大腸癌中microRNAs表達水平.pdf

1、目的：大腸癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍內(nèi)，大腸癌的發(fā)病率男女均處于惡性腫瘤的第3位，其中在西方發(fā)達國家，大腸癌的發(fā)病率處于第2位。2003年美國大腸癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均居美國癌癥發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)的第3位。在我國，隨著生活水平的不斷提高，飲食習慣的改變，大腸癌的發(fā)病率呈上升態(tài)勢，排在惡性腫瘤和致死因素的第4位。雖然大腸癌的生物學惡性行為較低手術(shù)切除后的5年生存率平均可達40％～60％，但大腸癌仍然是我國腫瘤患者死亡的主要

2、原因之一。因此，進一步提高臨床醫(yī)師對大腸癌的診治水平是十分必要的。其中，及時發(fā)現(xiàn)大腸癌的癌前病變、早期診斷，早期治療以及開規(guī)范化的手術(shù)治療是提高大腸癌療效的關(guān)鍵。腫瘤相關(guān)基因的研究可能在將來為臨床上大腸癌的早期診斷，術(shù)前分期，術(shù)后監(jiān)測復發(fā)轉(zhuǎn)移，選擇化療方案提供有意義的參考依據(jù)。 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一種真核生物內(nèi)源性小分子單鏈RNA，長18—25nt，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小RNA。miRNAs分

3、子通過形成RNA誘導沉默復合體(RNA induced silencing complex，RISC)與靶基因3‘端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)不完全互補結(jié)合，誘導mRNA的切割降解，翻譯抑制或者其他形式的調(diào)節(jié)機制抑制靶基因的表達。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在大腸癌組織及大腸癌細胞系中異常表達，一部分在癌細胞中較正常細胞表達明顯下降如miR—143、miR—145、let—7、miR—34a等，一部分表達則

4、升高如miR—31、miR—21等。miRNAs在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要作用，尋找與大腸癌相關(guān)的miRNAs分子，闡明其作用機制，將可能豐富大腸癌的病因?qū)W和分子病理學理論。miRNAs表達譜在大腸癌細胞與正常組織細胞中存在明顯差異，有研究稱在大腸癌發(fā)生的腺瘤階段即有差異，因此miRNAs在大腸癌早期診斷方面可能有重要意義。目前的研究還發(fā)現(xiàn)，一些化療藥物如5—Fu能改變大腸癌細胞中某些miRNAs分子表達水平，提示我們miRNA

5、s可能作為化療藥物作用靶點，為新型抗癌藥物的開發(fā)提供新的策略和思路。 文中參考國內(nèi)外相關(guān)文獻，結(jié)合前期試驗預測高度可能與大腸癌相關(guān)的miRNAs分子。應(yīng)用Real-Time RT-PCR技術(shù)，針對預測得到的miRNAs分子，在大腸癌組織和對應(yīng)正常大腸粘膜中進行表達水平檢測，并結(jié)合術(shù)后病理資料，分析miRNAs與大腸癌臨床病理因素的相關(guān)性，以其為大腸癌早期診斷和抗轉(zhuǎn)移治療提供新的線索。 方法：試驗對象是2007年11月至2

6、009年5月份在中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤外科住院手術(shù)治療的31例大腸癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織，術(shù)中標本移出體外后立即切取一部分迅速置于液氮中冷凍后—80℃保存?zhèn)溆?，剩余送往病理室做病理檢查。全部患者均經(jīng)病理證實為大腸癌，全組平均年齡60.3歲，其中男12例女19例，詳細記錄腫瘤臨床病理學參數(shù)，同時收集距癌灶5厘米以上正常腸粘膜組織作為正常對照。本實驗采用美國Ambion公司microRNA提取試劑盒，按照說明提取組織RNA，然后在R

7、NA3’端人為地加上ploy(A)尾巴，之后進行反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR法檢測miR—18b，miR—21，miR—148b，miR—365在大腸癌組織及癌旁正常腸粘膜中表達水平。采用2—△△CT算法計算癌組織與癌旁組織中miRNAs表達量的比值，結(jié)合術(shù)后病理參數(shù)，分析microRNAs在不同病理特征大腸癌組間表達的差異。試驗結(jié)果采用SPSS13.0軟件進行四格表、行列資料表卡方檢驗或Fisher確切概率法檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學意

8、義。 結(jié)果：1.RNA加ploy(A)尾引物延伸RT-PCR法。microRNAs是長約22nt的單鏈小分子RNA，由于片段過短，無法設(shè)計上下游引物，因而不能用常規(guī)的PCR法檢測，。因此本實驗參考國內(nèi)外最新文獻，采用在RNA3’端加ploy(A)尾巴，長約70-150個A(腺苷酸)，然后再設(shè)計長約60nt反轉(zhuǎn)錄引物，引物5’端為24個T(胸腺嘧啶核苷酸)加錨定單堿基(A，C，G)。這樣就將長約22nt的microRNAs反轉(zhuǎn)錄成

9、為長約80nt的cDNA，再進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)測序后證實為目的序列。我們認為此種方法是檢測microRNAs的一種簡單有效方法，而且費用相對較低。2.miR—18b，miR—21，miR—148b，miR—365與大腸癌臨床病理因素。本實驗結(jié)合術(shù)后病理資料，分析了31例大腸癌的臨床病理因素與4種microRNAs表達差異的關(guān)系，包括腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無、淋巴管癌栓有無、Duke分期、浸潤深度、組織類型、生長方式等。統(tǒng)計學結(jié)果顯示

10、在不同浸潤深度組別中，miR—18b表達水平存在明顯差異，隨著浸入深度增加，miR—18b表達上調(diào)比例明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)。未發(fā)現(xiàn)不同病理特征組間其他3種microRNAs表達水平存在明顯差異，其所有統(tǒng)計結(jié)果P值均大于0.05。 結(jié)論：1、RNA加尾引物延伸熒光定量real-Time PCR法是一種簡單有效的microRNAs檢測方法。2、miR—18b表達上調(diào)與大腸癌浸潤深度相關(guān)(P<0.05)，miR—