水稻基因激活標(biāo)簽體系的建立及初步分析.pdf

1、本研究利用T-DNA插入突變技術(shù)創(chuàng)制水稻基因激活標(biāo)簽突變?nèi)后w，并對(duì)該激活標(biāo)簽群體和以前創(chuàng)制的增強(qiáng)子捕獲群體的再生植株的T-DNA側(cè)翼序列一系列分析及激活標(biāo)簽系的RT-PCR分析，探討了激活標(biāo)簽載體pER38在水稻功能基因組的研究中的重要作用。 本研究是中國(guó)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目“水稻突變體庫(kù)的創(chuàng)制與功能基因組學(xué)研究”的一部分。主要取得了以下主要研究進(jìn)展： 1.通過(guò)與合作者的共同努力，建立了高效、快速的大規(guī)模

2、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻T-DNA插入突變遺傳轉(zhuǎn)化體系，從成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織開(kāi)始，約90d后即可得到轉(zhuǎn)化植株。獲得潮霉素抗性愈傷組織的效率超過(guò)90％，由抗性愈傷組織分化再生植株的效率超過(guò)80％，PCR和Southern雜交檢測(cè)表明大約95％的潮霉素抗性植株含有T-DNA插入片段。提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵在于共培養(yǎng)溫度從28-30℃降低至19～22℃，并在選擇培養(yǎng)10～15d后及時(shí)選擇繼代培養(yǎng)4～12d。利用上述程序構(gòu)建了大規(guī)模的水稻基因激活標(biāo)簽突

3、變體庫(kù)(約5萬(wàn)份)。 2.利用PCRwalking和Tail-PCR技術(shù)對(duì)激活標(biāo)簽PER38和以前創(chuàng)建的增強(qiáng)子捕獲標(biāo)簽pFX-E24.2-15R兩個(gè)體系產(chǎn)生的再生植株T-DNA側(cè)翼序列進(jìn)行分離，分別獲得172條和493條水稻水稻基因組側(cè)翼序列。通過(guò)對(duì)兩個(gè)體系的側(cè)翼序列的分離效率；T-DNA的插入位點(diǎn)整合模式比較分析；T-DNA插入位點(diǎn)的分布分析以及激活標(biāo)簽系RT-PCR的分析，結(jié)果表明： (1)激活標(biāo)簽載體PER38獲得

4、的再生植株獲得T-DNA的側(cè)翼序列明顯高于增強(qiáng)子捕獲載體pFX-E24.2-15R，比例分別為63.2％和38.1％。 (2)通過(guò)側(cè)翼序列的分析，兩個(gè)載體的T-DNA在基因區(qū)的分布相似，在基因區(qū)分布頻率較高，基因間隔區(qū)及重復(fù)區(qū)則較少；在染色體上分布與Genbank中報(bào)道的putativeexpressed和expressed的基因分布相近，而與hypotheticalgene則明顯不相關(guān)。 (3)通過(guò)激活標(biāo)簽系的RT-P