殼聚糖納米粒固定化凝血酶的制備及應用的初步研究.pdf

1、止血是外科手術的基本操作，傳統(tǒng)止血方法遇有不可控制的出血時效果欠佳。新型止血敷料是新近研發(fā)的一種局部快速止血材料，通過加強局部凝血因子濃度、血小板數量和質量、血管收縮功能等生理止血因素，并結合堵塞、壓迫、熱止血等傳統(tǒng)方法，達到快速止血的目的，有些還具有多功能敷料的特性。它的應用使外科的這一止血現(xiàn)狀大為改善。但是，現(xiàn)有新型止血敷料尚存在環(huán)境穩(wěn)定性、副損傷、止血效果不確切、價格昂貴等多方面問題。 納米止血材料是外科止血領域的最新發(fā)展

2、。納米材料有著獨特的性質(如表面效應、尺寸效應、隧道效應等)，使之為外科止血提供了獨立于縫扎、電凝、填塞、促進凝血栓形成等方法之外的新途徑。但是納米止血技術剛剛起步，有待完善。 酶固定化技術使提高現(xiàn)有止血劑的環(huán)境穩(wěn)定性成為可能，特別是提高凝血酶等生物止血材料的穩(wěn)定性，有著獨特的優(yōu)勢。當前，已有固定化凝血酶的文獻報道。納米技術固定化酶可以有效減小空間效應、分配效應、擴散效應等多種效應對酶動力學的影響，最大限度提高酶活性收率，但尚未

3、發(fā)現(xiàn)關于納米技術固定化凝血酶的相關研究。 本論文著眼于手術和急救的止血需要，整合納米技術、酶固定化技術于新型止血材料中，提出以下設想： 1．以天然止血材料殼聚糖為原材料，運用離子交聯(lián)技術，制備納米粒，實現(xiàn)止血材料的納米化，從而改變殼聚糖的止血特性，同時進一步研究納米止血材料的止血機理。 2．以殼聚糖納米粒為載體，運用酶固定化技術，對凝血酶進行改性，提高其環(huán)境穩(wěn)定性，拓寬其使用范圍，為發(fā)展新一代納米止血材料做基礎研

4、究。 第一部分：殼聚糖納米微粒的制備及表征 研究內容： 本部分內容著眼于運用離子交聯(lián)法制備合適的粒徑較小的殼聚糖納米粒固定化酶載體，以期減小固定化過程和固定化載體對酶動力學的影響，得到最大的酶活性收率，為下面的實驗做基礎研究。 結果： 在最佳條件下制得的納米粒粒徑最小，平均粒徑為28.4nm，粒徑分布較集中，可滿足納米粒固定化酶載體的要求。經TEM觀察，粒子成球性好。紅外光譜研究顯示，殼聚糖分子的

5、氨基與TPP的磷酸基之間有較強的靜電結合作用。 結論： 以殼聚糖和三聚磷酸鈉為載體材料，采用離子交聯(lián)法制備CS-TPP納米粒，該納米微粒粒徑小，成球性較好，可滿足未來固定化凝血酶的要求。 第二部分：殼聚糖納米粒固定化凝血酶的制備及性質 研究內容： 本部分集中研究殼聚糖固定化凝血酶(CS-TPP-TH納米粒)的制備方法、影響因素，進而探討CS-TPP-TH納米粒的包封率、載藥率以及其活性收率和環(huán)境穩(wěn)

6、定性。 結果： 凝血酶初始量影響到CS-TPP-Th納米粒粒徑，Th/CS=0.8時，CS-TPP-Th納米粒粒徑最小為35.3nm，同時還影響其包封率和載藥率。CS-TPP-Th納米粒的最適溫度為40℃，最適pH值為6.9，37℃環(huán)境下活性收率為66.96﹪，半衰期為120h。 結論： CS-TPP納米粒通過納米粒包埋法、電荷吸附法固定化凝血酶，可以不改變凝血酶的結構；同時，納米級的固定化載體，減小了空

7、間效應、分配效應、擴散效應對固定化凝血酶的活性影響，因此，在大幅度提高固定化酶的穩(wěn)定性的同時，保證了較大的酶活性收率。 第三部分：殼聚糖納米粒固定化凝血酶的凝血功能檢測和動物實驗 研究內容： 本部分實驗通過對CS-TPP-Th納米粒的實驗室檢測，對其凝血功能及機理進行評估與研究，進而研究納米止血材料的止血機理；最后制作多種動物出血模型，對CS-TPP-Th納米粒凍干粉進行初步的應用研究。 結果：

8、CS-TPP-Th納米粒和殼聚糖對RBC聚集性的影響沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，前者可明顯減少凝血時間(P<0.05)；動物實驗中，CS-TPP-Th納米粒凍干粉可以用于各種類型的出血創(chuàng)面，可明顯縮短創(chuàng)面的即時止血時間、減少出血量(P<0.05)，降低再出血發(fā)生率和死亡率；組織學檢查未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維組織增生，且部分納米粒已經被吸收。 結論： CS-TPP-Th納米粒通過納米粒的表面效應、影響RBC聚集、凝血酶的直接作