交鏈孢霉酚誘導細胞DNA聚合酶β基因突變及表達的分析.pdf

1、背景與目的 霉菌毒素在腫瘤病因學上的作用已經被大多數(shù)學者認同。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)的霉菌毒素主要在基因水平導致基因突變而致癌。其中交鏈孢霉酚(Alternariol，AOH)和交鏈孢酚單甲醚(A1ternari-oimonomtyhiether，AME)已證明具有強的致癌性[2]。而DNA聚合酶β(polymerasepolβ)是DNA聚合酶家族中的一員，在DNA損傷修復中起著重要的作用，它主要對卜4個堿基突變進行堿基切除修復(base

2、excisionrepair，BER)。已經證實在多種腫瘤中DNApolβ的表達是增高的，且有多種形式的堿基突變。然而霉菌毒素的致癌機制與polβ是否有一定的關系，國內外還沒有相關報道。本試驗將野生型poiB及空載體分別轉染入NIH3T3細胞，分別獲得穩(wěn)定表達野生型polB及空載體的NIH3T3細胞株；用不同濃度的AOH誘導這些細胞，觀察AOH對polβ的致突變作用及其對細胞蛋白表達的影響。為霉菌毒素致病機制的分子水平研究也為poiβ在

3、基因治療方面的研究提供重要依據(jù)。 實驗方法 1．細胞培養(yǎng)轉染及AOH誘導 1．1從DH5α細菌中提取質粒pEGFP—C3、pEGFP—C3一polβ。 1．2將質粒用脂質體包裹轉染入NIH3T3細胞；G418篩選2周；得到穩(wěn)定高表達轉染野生型p01B和轉染空質粒的NIH3T3細胞株。 1．3藥物誘導轉染pEGFP—C3一polB的N’[H3T3細胞、pEGFP—C3的NIH3T3細胞及未轉染的NI

4、H3T3細胞48小時。 2．提取mRNA逆轉錄出cDNA，擴增出polβ全基因，插入T載體，進行DNA序列測定，并利用DNASIS軟件分析發(fā)現(xiàn)突變位置和形式，推測突變對氨基酸的改變和對polB蛋白高級結構的影響。 3．半定量RT-PCR測定po]B基因表達量的變化。 4．提取細胞總蛋白并測定蛋白質濃度，進行雙向電泳。并用PDQuest7．1．1凝膠圖像分析軟件分析電泳結果，比較三個樣本的電泳圖譜，尋找差異表達蛋白

5、。 實驗結果 1．未轉染的NIH3T3細胞和轉染pEGFP-C3的NIH3T3細胞DNApolB基因突變點個數(shù)隨AOH濃度升高增多，而轉染pEGFP-C3-polB的NIH3T3細胞DNApolβ基因在L5μmol／L和2．0μmol／L的AOH濃度誘導下未見突變發(fā)生，當AOH濃度增大到2．5umol／L才出現(xiàn)DNApolβ基因突變。 2．未轉染的NIH3T3細胞和轉染pEGFP-C3的NIH3T3細胞在1．5u

6、mol／L濃度的AOH誘導下，74位A—G，導致氨基酸由天冬酰胺變?yōu)樘於彼幔?57位A—T，導致氨基酸由賴氨酸變?yōu)楫惲涟彼?；?．0umol幾濃度的AOH誘導下，208位A—G，未造成氨基酸改變，250位T—C，未造成氨基酸改變，372位C—T，導致氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸；在2．5μm01／L濃度的AOH誘導下，332位A—G，導致氨基酸由天冬酰胺變?yōu)樘於彼幔?23位A—G，導致氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸，433位A—G，未造成氨

7、基酸改變，851位T—C，導致氨基酸由酪氨酸變?yōu)榻M氨酸。而轉染pEGFP-C3-polB的NIH3T3細胞在1．5umol／L和2．Oμmol／L濃度的AOH誘導下未見突變發(fā)生；當其AOH濃度增加為2．5umol／L時有突變發(fā)生，84位T—C，導致氨基酸由異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸，¨3位T—C，導致氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔?76位T—C，導致氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔?70位A—G，導致氨基酸由賴氨酸變?yōu)楦拾彼帷?3．在AOH誘

8、導下，三種細胞polB表達量都有升高的現(xiàn)象，且隨AOH濃度升高而升高；但在同樣濃度的AOH誘導下，轉染野生型的polβ的NIH3T3細胞的poiB升高的程度較未轉染的NIH3T3細胞和轉染空載體的NIH3T3細胞的表達量升高程度低(P

9、組有pH約4．3，分子量約40kD和洲約5．2，分子量約15kD的差異蛋白表達。 結論 1．一定濃度的AOH誘導可導致DNApolβ的突變，可以使NIH3T3細胞polB表達量增高。提示食管癌的霉菌毒素病因的分子機制，可能與其使DNApolβ喪失或降低修復活性有關。2．轉染野生型DNApolB能夠一定程度抵抗AOH對NIH3T3細胞的致突變作用。polB抵抗AOH致突變作用的臨界濃度可能是2．5μmol／L。 3