慢性粒細(xì)胞白血病中BCR-ABL調(diào)控Survivin機(jī)制的初步研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)，年發(fā)病率為1/10萬，是發(fā)生在造血干細(xì)胞的惡性骨髓增殖性疾病，同時(shí)也是我國慢性白血病中最常見的一種。慢粒的臨床分期可分為慢性期(CP)、加速期(AP)和急變期(BP)，發(fā)生急變后預(yù)后極差，在短期內(nèi)死亡。95％的慢?；颊呔哂蠵h染色體，并存在BCR-ABL1融合基因的表達(dá)。Ph染色體是9號(hào)和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂易位的結(jié)果，易位使9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q34)上的原癌基因

2、ABL和22號(hào)染色體(22q11)上的BCR基因重新組合成BCR-ABL融合基因。在CML中，BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)錄為8.5kb的mRNA，并進(jìn)一步翻譯產(chǎn)生分子質(zhì)量為210KD的BCR-ABL融合蛋白P210bcr/abl，該蛋白可作用于一系列下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括RAS/絲裂原活化蛋白激酶通路（RAS/MAPK）、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子通路（JAK/STAT）、磷脂酞肌醇3激酶/蛋白激酶B通路(PI3K/AKT)、

3、MYC通路等，不但調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，影響細(xì)胞的增殖和凋亡，而且引起造血干細(xì)胞調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和分化的必須黏附程序的缺失，最終導(dǎo)致骨髓祖細(xì)胞大量增生、凋亡減少與骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附性下降，使大量不成熟的髓細(xì)胞釋放到外周血，導(dǎo)致慢粒的發(fā)生。因此，BCR-ABL被認(rèn)為是慢粒發(fā)病的分子基礎(chǔ)，也是慢粒診斷、療效觀察、預(yù)后判斷的有效指標(biāo)。在慢粒的治療中，伊馬替尼(imatinib，IM)作為一種酪氨酸激酶抑制劑，一直是治療慢粒的一線用藥。伊馬替尼在體內(nèi)外均可強(qiáng)烈抑

4、制ABL酪氨酸激酶的活性，特異性地抑制V-ABL的表達(dá)和細(xì)胞的增殖。伊馬替尼通過占據(jù)BCR-ABL融合蛋白的ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制BCR-ABL蛋白的自身磷酸化和底物磷酸化，使BCR-ABL陽性細(xì)胞的增生受抑制或者凋亡。然而，隨著該藥臨床應(yīng)用的推廣，逐漸出現(xiàn)了對(duì)伊馬替尼耐藥現(xiàn)象。耐藥的發(fā)生主要有兩方面的原因:一是存在原始的白血病干細(xì)胞(LSCs)不受目前治療藥物的影響;二是BCR-ABL點(diǎn)突變。其中有50％以上的耐藥是因?yàn)锽CR-ABL突變

5、，導(dǎo)致伊馬替尼不能與融合蛋白ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。miRNA是基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的研究熱點(diǎn)，它參與腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并影響腫瘤的發(fā)生。有研究證實(shí)miRNA-196b在急性粒細(xì)胞白血病(AML)中低表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)miRNA-196b對(duì)MLL的發(fā)展起重要作用。因此認(rèn)為對(duì)miRNA-196b及其靶基因的研究對(duì)于正常造血過程具有重要意義。而在本課題組之前的研究中，已經(jīng)驗(yàn)證了miRNA-196b的靶基因?yàn)锽CR-ABL，miRNA-196b

6、過表達(dá)，則BCR-ABL表達(dá)降低或不表達(dá);抑制miRNA-196b表達(dá)，則BCR-ABL表達(dá)升高。與miRNA相比，小干擾RNA（siRNA）也是參與RNA干擾(RNAi)的一種主要RNA，可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。目前，采用化學(xué)合成法合成siRNA對(duì)目的基因進(jìn)行干擾的實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)非常成熟，已有部分學(xué)者對(duì)BCR-ABL融合基因的小干擾RNA進(jìn)行研究。慢粒的發(fā)生、進(jìn)展都高度依賴BCR-ABL的活性，伊馬替尼可以直接作用于BCR-

7、ABL融合蛋白， miRNA-196b和siRNA可以通過作用于BCR-ABL融合基因，從RNA水平干擾調(diào)控BCR-ABL的表達(dá)，最后影響下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此，我們對(duì)其中的一些基因進(jìn)行了研究。本研究發(fā)現(xiàn)生存素(Survivin)是BCR-ABL激活的信號(hào)通路中的一個(gè)下游基因，在胃癌、肺癌、老年急性白血病等疾病中，Survivin與環(huán)氧化酶(Cox-2)表達(dá)密切相關(guān)，發(fā)揮協(xié)同作用或Survivin水平依賴于Cox-2的表達(dá)。是否Cox-

8、2也是BCR-ABL的下游基因并受到BCR-ABL的調(diào)控，我們采用miRNA、IM、siRNA三種不同的方法處理K562細(xì)胞，觀察Survivin和Cox-2的表達(dá)變化，分析不同處理方法對(duì)Survivin和Cox-2表達(dá)的影響，進(jìn)一步了解BCR-ABL與Cox-2之間的關(guān)系。在BCR-ABL相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，PI3K/Akt途徑的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，而PTEN基因則可抑制此途徑，并在抑制過程中調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)進(jìn)一

9、步抑制HIF-1α下游的基因。在一些腫瘤的研究中已證實(shí)受HIF-1α調(diào)控的下游基因有:VEGF、Survivin、Bcl-2、Bax等，即Survivin基因在轉(zhuǎn)錄水平受到HIF-1α的調(diào)控而升高。我們推測(cè)，在慢性粒細(xì)胞白血病中， Survivin、PTEN、HIF-1α三個(gè)基因的表達(dá)有一定的關(guān)系。在本研究中我們對(duì)Survivin、Cox-2、HIF-1α和PTEN基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步分析BCR-ABL下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

10、　　 本研究主要包括以下兩個(gè)方面。第一部分：三種方法抑制BCR-ABL的表達(dá)。包括miRNA-196b慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞構(gòu)建K562-196b細(xì)胞株; IM處理細(xì)胞;化學(xué)合成siRNA-ABL轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞。對(duì)處理得到的細(xì)胞利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin V-PE法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，K562-196b組細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下可清楚觀察到綠色熒光蛋白，且實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示miRNA-196b的表達(dá)是

11、K562組細(xì)胞的10.32倍，證明K562-196b細(xì)胞株構(gòu)建成功。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot的結(jié)果顯示，miRNA-196b、IM和siRNA三種處理方法都可以有效的抑制BCR-ABL的表達(dá)，該結(jié)果表明三組處理組細(xì)胞均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)IM處理組中miRNA-196b的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果K562-IM組miRNA-196b的表達(dá)顯著高于K562組(P＜0.05)，該結(jié)果表明，miRNA-196b與BCR-ABL之間存

12、在一調(diào)節(jié)回路。增殖和凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-196b、IM和siRNA三種處理方法從RNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)不同的水平干擾抑制BCR-ABL，都可以達(dá)到抑制K562細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用。第二部分：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Survivin、Cox-2 mRNA的表達(dá)，分析BCR-ABL與Cox-2之間是否有調(diào)控關(guān)系;檢測(cè)HIF-1α、PTEN mRNA的表達(dá)，分析探討Survivin與PTEN、HIF-1α三個(gè)基因的表達(dá)之間的關(guān)系。

13、結(jié)果顯示，Survivin mRNA在K562-196b中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007);在K562-IM中表達(dá)與K562組相比略有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.715);在K562-siRNA-ABL中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。Cox-2 mRNA在三個(gè)處理組中的表達(dá)與K562組基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HIF-1αmRNA在K562-196b中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0

14、.007);在K562-IM中表達(dá)與K562組基本一致，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.943);在K562-siRNA-ABL中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)。PTENmRNA在三個(gè)處理組中的表達(dá)均升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，在K562細(xì)胞中成功驗(yàn)證了Survivin為BCR-ABL信號(hào)通路下游的基因;在K562細(xì)胞中Cox-2的表達(dá)不受到BCR-ABL的調(diào)控;且在抑制BCR-ABL表達(dá)的三個(gè)處