LPS致早期新生鼠腦白質(zhì)損傷中TLR4、TNF-α表達(dá)及倍他米松的保護(hù)作用.pdf

1、目的:早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷(WMD)是極低出生體重兒腦損傷的主要形式，發(fā)病率高且預(yù)后差。目前認(rèn)為宮內(nèi)感染、炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致早產(chǎn)兒WMD的重要因素。國(guó)外已有研究證實(shí)WMD發(fā)生于髓鞘形成的高峰期，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(preOL)是WMD的靶細(xì)胞。該研究通過(guò)向2日齡(P2)新生鼠腹腔注射不同劑量的脂多糖(LPS)，動(dòng)態(tài)觀察新生鼠腦白質(zhì)區(qū)病理改變和細(xì)胞凋亡的變化，以及髓鞘發(fā)育的情況，制備出WMD的動(dòng)物模型；分別采用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法檢測(cè)腦組織中TL

2、R4及TNF-α表達(dá)的變化并探討其與損傷的關(guān)系；以腦發(fā)育相對(duì)成熟的7日齡(P7)新生鼠作為對(duì)照，研究LPS對(duì)不同成熟程度腦白質(zhì)的影響；并探討不同劑量、不同時(shí)間注射倍他米松(Beta)對(duì)WMD是否具有保護(hù)作用。 方法: 分別向隨機(jī)分組的P2新生鼠腹腔注射藥物：A組注射LPS(A1組1.0mg/kg、A2組2.5mg/kg、A3組5.0mg/kg)；B組為Beta干預(yù)組(B1組在注射LPS5.0mg/kg的同時(shí)注射Beta2

3、.0mg/kg，B2、B3組分別在注射LPS5.0mg/kg前16小時(shí)注射Beta2.0mg/kg、4.0mg/kg)；C組向P7新生鼠注射LPS5.0mg/kg；D組為鹽水對(duì)照組，向P2新生鼠腹腔注射無(wú)菌鹽溶液。采用HE染色檢測(cè)各組新生鼠注藥后24h、P14時(shí)腦白質(zhì)區(qū)病理變化，原位末端標(biāo)記法(Tunel)檢測(cè)給藥后24h腦白質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡的變化；免疫組化法檢測(cè)各組給藥后24hCNPase表達(dá)的變化及P14時(shí)MBP表達(dá)的變化；免疫組化法及

4、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法觀察A3組新生鼠注藥后1h、2h、3h、4h、6h腦組織內(nèi)TLR4及TNF-α表達(dá)的變化，不同劑量LPS給藥后2h時(shí)TLR4和4h時(shí)TNF-α表達(dá)的變化。 結(jié)果: ① 給藥后24h，A3組新生鼠12.5％(1/8)死亡，存活者28.6％(2/7)可見(jiàn)胼胝體區(qū)、外囊區(qū)灶性出血和/或側(cè)腦室內(nèi)出血，B1組可見(jiàn)外囊區(qū)灶性出血，甚至皮層、皮層下白質(zhì)、尾狀核區(qū)可見(jiàn)大量的點(diǎn)片狀出血；P14時(shí)A3組胼

5、胝體區(qū)可見(jiàn)軟化灶，軟化灶的周?chē)心z質(zhì)細(xì)胞的增生，其他組則無(wú)明顯病理改變。 ② 注藥后24h胼胝體區(qū)可見(jiàn)棕褐色核染的凋亡細(xì)胞，A1組與對(duì)照組相比無(wú)差異，隨著LPS劑量的增加，凋亡細(xì)胞百分比逐漸增加，與對(duì)照組相比，A2組凋亡細(xì)胞百分比增加(6.38±0.74vs4.88±1.25，P＜0.05)，A3組差異更為顯著(21.43±1.72vs4.88±1.25，P＜0.01)；與A3組相比，B1組凋亡細(xì)胞百分比增高(23.13±1.1

6、3vs21.43±1.72，P＜0.05)，而提前給予Beta的B2、B3組凋亡細(xì)胞百分比明顯減少，且隨著B(niǎo)eta劑量的增加，凋亡細(xì)胞百分比也明顯減少(13.63±1.06vs21.43±1.72，P＜0.01；5.63±1.06vs21.43±1.72，P＜0.01)；與A3組相比，C組凋亡細(xì)胞百分比明顯減少(8.75±1.28vs21.43±1.72，P＜0.01)。 ③ 給藥后24h，腦室周?chē)踪|(zhì)區(qū)中可檢測(cè)到胞漿及突起CN

7、Pase陽(yáng)性染色的未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，A1組與D組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，但隨著LPS劑量的增加，染色逐漸變淡(P＜0.01)；與A3組相比，B1組染色更淡，而B(niǎo)2、B3組則染色加深，且隨著B(niǎo)eta劑量的增加，染色更深(P＜0.01)。 ④ P14時(shí)，在胼胝體、放射冠和內(nèi)、外囊白質(zhì)束可以清楚地檢測(cè)到MBP陽(yáng)性染色，A1、A2組與D組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)，隨著LPS劑量的增加，A3組MBP染色明顯減少(P＜0.01)

8、；與A3組相比，B1組無(wú)明顯改變(P＞0.05)，而B(niǎo)2、B3組染色加深，且隨著B(niǎo)eta劑量的增加，染色更深，C組也較A3組染色明顯加深(P＜0.01)。 ⑤ 腦組織中脈絡(luò)叢、軟腦膜及胼胝體區(qū)細(xì)胞胞漿中有不同程度的TLR4陽(yáng)性表達(dá)，與對(duì)照組相比，A3組給藥后1h即有TLR4表達(dá)減低(P＜0.05)，2h達(dá)最低值(P＜0.01)，3h后表達(dá)漸增強(qiáng)，但仍低于對(duì)照組(P＜0.01)，4h恢復(fù)到原來(lái)的水平；給藥后2h，A1組與對(duì)照組均可

9、見(jiàn)較多TLR4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，兩者無(wú)差異(P＞0.05)，隨著LPS的劑量的增加，A2、A3組TLR4陽(yáng)性表達(dá)逐漸減低(P＜0.01)，且隨著LPS劑量的增加降低更明顯(P＜0.01)；與A3組相比，B1組給藥后2h，TLR4表達(dá)無(wú)明顯變化或表達(dá)減低，而B(niǎo)2、B3組TLR4表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)，且隨著B(niǎo)eta劑量的增加TLR4的表達(dá)增加越明顯；C組給藥后2hTLR4的表達(dá)高于A3組(P＜0.01)。 ⑥ 與對(duì)照組相比，A3組注

10、藥后腦組織內(nèi)TNF-α陽(yáng)性染色細(xì)胞逐漸加深，且面積增大，4h達(dá)高峰，此后緩慢下降；新生鼠注射不同劑量的LPS后4h，A1組腦組織中僅見(jiàn)少量TNF-α陽(yáng)性表達(dá)，與對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05)，而隨著LPS劑量的增加，TNF-α陽(yáng)性染色逐漸增加(P＜0.01)。與A3組相比，B1組給藥后4h，TNF-α表達(dá)增加(P＜0.05)，而B(niǎo)2、B3組TNF-α表達(dá)減低(P＜0.01)，且隨著B(niǎo)eta劑量的增加TNF-α的表達(dá)減低越明顯；C組給藥后4

11、hTNF-α的表達(dá)低于A3組(P＜0.01)。 結(jié)論: 新生鼠腹腔注射一定劑量的LPS可使腦白質(zhì)區(qū)發(fā)生出血、軟化和凋亡細(xì)胞增加，髓鞘發(fā)育延遲或髓鞘損傷，從而導(dǎo)致WMD；TLR4是LPS致新生鼠WMD的重要受體，TNF-α是WMD發(fā)生中重要的細(xì)胞因子，他們可以反映WMD的程度；WMD的發(fā)生與腦的成熟程度密切相關(guān)；提前給予Beta可抑制LPS所致的TLR4表達(dá)降低，降低TNF-α的表達(dá)，減少腦白質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)髓鞘發(fā)育成熟