泛素-蛋白酶體途徑參與人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程的研究.pdf

1、目的：泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasomepathway，UPP)是一種高效的蛋白分解途徑，在許多細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)作用；UPP還有非蛋白水解作用。組織、細(xì)胞的衰老和應(yīng)激會(huì)引起該途徑的變化?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多老年性疾病的發(fā)生與UPP功能下降相關(guān)。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration，ARMD，AMD)是發(fā)達(dá)國(guó)家老年人群主要的致盲疾病之一。目前AMD發(fā)病的機(jī)理尚不明了。視網(wǎng)膜色素

2、上皮細(xì)胞(retinalpigmentepithelium，RPE)在AMD發(fā)病中的作用已引起廣大研究人員的重視?；趯?duì)UPP在老年性疾病中作用的認(rèn)識(shí)，以及探明AMD發(fā)病機(jī)理的重要性，本研究在證實(shí)UPP可能參與快速衰老小鼠(senescence-acceleratedmouse，SAM)P8模型視網(wǎng)膜老化過(guò)程的基礎(chǔ)上，采用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型，檢測(cè)UPP在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(ARPE-19)氧化應(yīng)激過(guò)程中的變化，探索抑制氧化應(yīng)

3、激的靶點(diǎn)，為臨床視網(wǎng)膜抗氧化，防止AMD尋找理想的干預(yù)方式。 方法：本研究首先用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)方法(包括DAB底物顯色方法和免疫熒光方法)檢測(cè)SAMP8和R1小鼠模型視網(wǎng)膜中泛素化蛋白和蛋白酶體的表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，先用不同濃度過(guò)氧化氫作用ARPE-19二十四小時(shí)后，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)方法檢測(cè)細(xì)胞活力。然后選擇不同濃度過(guò)氧化氫作用細(xì)胞4小時(shí)后收集樣本，RT-PCR和wes

4、ternblot方法檢測(cè)細(xì)胞中泛素化蛋白和蛋白酶體的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry,ICC)方法檢測(cè)泛素化蛋白和蛋白酶體在細(xì)胞中的分布變化。在蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)ARPE-19氧化應(yīng)激中氧化蛋白表達(dá)影響的研究中，先用MG-132預(yù)處理細(xì)胞90分鐘，再給予細(xì)胞過(guò)氧化氫處理4小時(shí)，用活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS的變化，westernblot方法

5、檢測(cè)細(xì)胞中羰基化蛋白的表達(dá)水平，ICC方法檢測(cè)羰基化蛋白在細(xì)胞中的分布。最后將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pcDNA3-PSMB5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ARPE-19中，用RT-PCR和westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PSMB5基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；再在氧化應(yīng)激條件下，用蛋白酶體活性檢測(cè)試劑檢測(cè)過(guò)表達(dá)PSMB5的ARPE-19中細(xì)胞糜蛋白酶活性變化，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性變化。 結(jié)果：與11月齡的SAMR1小鼠相比，11月齡的SAMP8小鼠視網(wǎng)膜中檢測(cè)到

6、泛素化蛋白的增加，PSMB5表達(dá)下降。50-300μM過(guò)氧化氫加入ARPE-19培養(yǎng)4小時(shí)后細(xì)胞活力保持在75％以上。分別用不同濃度過(guò)氧化氫50-300μM作用ARPE-19四個(gè)小時(shí)后，泛素基因UbA52和UbB轉(zhuǎn)錄增加，細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白及蛋白酶體的表達(dá)增加，泛素化蛋白和蛋白酶體的分布多集中在核內(nèi)及核膜周圍。在50μM過(guò)氧化氫作用一小時(shí)時(shí)RPE細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體糜蛋白酶活性增加，而200μM和300μM過(guò)氧化氫作用后活性下降。用MG-132

7、預(yù)處理后再給予細(xì)胞過(guò)氧化氫刺激4小時(shí)收集細(xì)胞，與未作MG-132預(yù)處理相比，細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增加，細(xì)胞中羰基化蛋白的表達(dá)水平明顯增加，細(xì)胞中羰基化蛋白聚集在胞漿和核周。將pcDNA3-PSMB5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ARPE-19中，與pcDNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，PSMB5基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平明顯增加。PSMB5過(guò)表達(dá)細(xì)胞在氧化應(yīng)激后，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體糜蛋白酶活性下降較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞低，而且細(xì)胞活力明顯高于空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組。 結(jié)論：UPP存在于S