慢病毒介導(dǎo)shRNA靶向沉默VEGF-A乳腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建.pdf

1、目的：通過構(gòu)建血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-A基因RNA干擾慢病毒載體，介導(dǎo)其對(duì)VEGF-A基因沉默，篩選并建立VEGF-A基因穩(wěn)定下調(diào)的乳腺癌細(xì)胞株。
　　方法：1.設(shè)計(jì)三對(duì)靶向VEGF-A的shRNA表達(dá)序列并連接到慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLB中，成功構(gòu)建pLB-VEGF-A/shRNA質(zhì)粒，并經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定;2.分別將構(gòu)建的重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒pCMVA8.91、被膜蛋白質(zhì)粒pMD.G通過lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染

2、至包裝細(xì)胞293FT細(xì)胞，生產(chǎn)慢病毒顆粒，同時(shí)利用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)其滴度;3.包裝產(chǎn)生慢病毒后感染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出GFP陽(yáng)性細(xì)胞，并收集培養(yǎng);4.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對(duì)VEGF-A在mRNA水平上的沉默效果進(jìn)行鑒定，并篩選出沉默效果最佳的干擾序列。
　　結(jié)果：1.PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pLB-VEGF-A/shRNA1，2

3、，3構(gòu)建成功;2.重組質(zhì)粒同另兩種包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后生產(chǎn)出的慢病毒顆粒滴度達(dá)108IU/ml;3.慢病毒顆粒分別感染MCF-7細(xì)胞，與空白對(duì)照組相比，三組特異性干擾組感染MCF-7細(xì)胞VEGF-A mRNA的表達(dá)量均下降，分別降低了(43.42±0.03)％、(68.18±0.02)％、(81.85±0.03)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中pLB-VEGF-A/shRNA3組VEGF-A基因沉默效果最明顯，表達(dá)量