植酸酶基因轉化棉花及轉基因植株再生.pdf

1、本研究采用基因槍轟擊轉化技術，將外源植酸酶基因(PhyA)導入棉花莖尖分生組織，初步獲得轉基因植株；利用根癌農桿菌轉化法將植酸酶基因導入棉花胚性愈傷組織，探討農桿菌侵染棉花胚性愈傷的轉化條件，并獲得抗性胚性愈傷組織；通過花粉管通道法將PhyA基因導入棉花，獲得經PCR檢測的轉基因植株。本研究旨在為棉花現(xiàn)代分子育種增添新的內容和新的種質材料，同時為解決農作物有效利用土壤有機磷資源開辟一條經濟有效的途徑。 利用棉花莖尖分生組織易于再

2、生的特點，將含有植酸酶基因(PhyA)的質粒包裹在金粉上，轟擊轉化陸地棉品種農大KB18的莖尖分生組織。摸索出了一條適合莖尖再生的途徑。對轟擊參數(shù)進行了綜合比較，優(yōu)選出最佳轟擊組合，確定了適合基因槍莖尖轉化體系的梯度篩選法。研究認為，培養(yǎng)莖尖的培養(yǎng)基以MSB附加30﹪葡萄糖，不添加或添加少量激素為佳；基因槍轟擊過程中，采用轟擊壓力1350psi，真空度28inchHg，轟擊距離9cm，轟擊1次，轉化效果最佳；轟擊后接入加有1g·L-1活

3、性炭的MSB培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)4-7d，至組織長出綠芽點時，將其轉入篩選培養(yǎng)基MSB+Kan(70、80、100、110、130、140mg·L-1)上進行梯度篩選，獲得15株卡那霉素抗性植株。PCR分析表明有8株抗性植株含有PhyA基因，PCR-Southern雜交分析進一步證實了PhyA基因在轉基因棉花基因組中的整合。從基因槍轟擊到獲得轉化小植株大約需要3個月時間，最終轉化率為2.97﹪。 用質粒PC-KSA2300表達單元轉

4、化農桿菌菌株EHA105的感受態(tài)細胞，構建了可直接用于遺傳轉化的農桿菌工程菌株。為了建立農桿菌介導的棉花轉基因技術體系，用獲得的農桿菌菌株侵染棉花胚性愈傷組織，摸索了影響其轉化的因素。結果表明：不同棉花品種間胚性愈傷組織的生長動態(tài)和對卡那霉素的敏感性有很大差異；農桿菌侵染時間在5-10分鐘、共培養(yǎng)時在18-21℃條件下培養(yǎng)1-2d，轉化效果較好，通過卡那霉素篩選培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織。對獲得的愈傷組織進行PCR檢測，初步證明PhyA基因