T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤基因重排及T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子受體表達(dá)模式的研究.pdf

1、淋巴瘤的病理診斷被公認(rèn)為是臨床病理中難度最大的,僅靠組織形態(tài)學(xué)以及免疫組化結(jié)果有時(shí)容易造成誤診及漏診。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,分子克隆分析無(wú)論是在淋巴瘤的初次診斷還是以后的隨訪中日益重要并且逐漸成熟,國(guó)外,特別是免疫球蛋白基因的克隆分析,已經(jīng)用于B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的常規(guī)病理診斷。T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin iymphoma,T-NHL)

2、是一種相對(duì)較少見(jiàn)且高度異質(zhì)性的惡性淋巴瘤,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)T-NHL的病理診斷還不太樂(lè)觀。T-NHL的病理診斷要解決兩個(gè)問(wèn)題,一是不是T-NHL?二是哪一種類型的T-NHL?也就是T-NHL的診斷和分類問(wèn)題。關(guān)于第一個(gè)問(wèn)題,由于T-NHL其形態(tài)多變以及免疫學(xué)上無(wú)克隆性標(biāo)記,主張對(duì)所有的T細(xì)胞增殖性疾病進(jìn)行分子克隆性基因重排分析,尤其是T細(xì)胞富裕的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤?？寺》治隽馨土龅脑硎腔谒袗盒粤馨图?xì)胞都有一個(gè)共同的克隆起源。目前淋巴

3、瘤的分子病理診斷中,聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction,PCR)因其快速、簡(jiǎn)單、高效、廉價(jià),敏感度高以及對(duì)DNA的質(zhì)和量要求不高等優(yōu)點(diǎn)而逐步取代了Southern blot。一般來(lái)說(shuō),PCR檢測(cè)的高靈敏度期望是從新鮮的或冰凍的樣本中分離得到DNA,而從福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)的組織樣本中分離得到的DNA使其敏感性有所降低。

4、不幸的是,在大部分的診斷病例以及回顧性研究中,僅能得到FFPE的組織樣本。從FFPE的組織樣本中分離出的DNA含有許多斷裂的并伴有化學(xué)修飾的短小靶序列,不利于分子診斷。如何提高FFPE樣本檢測(cè)的敏感性是研究者面對(duì)的一個(gè)難題。另一方面不同文獻(xiàn)中所選擇的引物,PCR循環(huán)參數(shù)以及PCR產(chǎn)物分析方法都不盡相同,檢測(cè)結(jié)果也有差異。因此,如何找到適合于常規(guī)臨床病理診斷的標(biāo)準(zhǔn)程序是研究者面對(duì)的另一個(gè)難題。實(shí)際上與新鮮的或冰凍的樣本相比,克隆分析FFP

5、E樣本的難度在于需要更多的實(shí)驗(yàn),本研究獲省科技廳項(xiàng)目(001110425)、浙江省自然科學(xué)基會(huì)項(xiàng)目(Y205292)和浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金(2006A084)資助其與大部分的體細(xì)胞基因PCR擴(kuò)增相比更為復(fù)雜。以PCR為基礎(chǔ)的克隆分析雖不是一項(xiàng)新穎的方法,但現(xiàn)有發(fā)表的文章很少有改變PCR參數(shù)擴(kuò)增FFPE樣本的DNA模板的研究分析。關(guān)于第二個(gè)問(wèn)題,分化標(biāo)記物表達(dá)的研究表明大多數(shù)T-NHL是由胸腺后T細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化發(fā)展而來(lái)的,因此這些惡

6、性腫瘤被稱為外周T細(xì)胞淋巴瘤(periferal T celllymphomas,PTCLs)。PTCLs一群高度異質(zhì)性的惡性淋巴瘤,其診斷、分類及分子發(fā)病機(jī)制的研究一直是腫瘤病理學(xué)中最為困難和最有爭(zhēng)議的領(lǐng)域之一。最新的2001年WHO分類標(biāo)準(zhǔn),已經(jīng)分化出了一些獨(dú)立存在的腫瘤實(shí)體,如腸病相關(guān)性T細(xì)胞淋巴瘤(enteropathy type T cell lymphoma,ETTCL),間變性大細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤(anaplasticla

7、gre T cell lymphoma,ALCL),血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-celllymphoma,AITL),鼻型T/NK細(xì)胞淋巴瘤以及肝脾γδT細(xì)胞淋巴瘤等等,除此之外,一種新PTCLs被分出,即非特指外周T細(xì)胞淋巴瘤(periferal T cell lymphomas,unspecified,PTCL-U),然而這一術(shù)語(yǔ)僅用來(lái)描述一類異質(zhì)性的淋巴瘤,而這類淋巴瘤有不同的臨床特征,組

8、織學(xué)特點(diǎn),基因改變,治療反應(yīng)以及相應(yīng)的預(yù)后。因此,詳細(xì)的PTCLs分類,尤其是PTCL-U有待于進(jìn)一步的澄清。迄今為止,T-NHL的分類大致基于形態(tài)學(xué)或臨床準(zhǔn)則。最近研究表明,正常T細(xì)胞亞群趨化因子受體的表達(dá)模式與該細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子相關(guān),CCR3選擇性表達(dá)在人類或小鼠的Th2細(xì)胞,CXCR3選擇表達(dá)在Th1細(xì)胞。基于以上原因,本實(shí)驗(yàn)以FFPE中T細(xì)胞受體(TCR)γ基因重排為研究對(duì)象,選用TCR多重引物,通過(guò)優(yōu)化DNA提取以及PC

9、R多個(gè)參數(shù)分析T-NHL中TCRγ基因重排,以建立PCR擴(kuò)增中不同變量性能改變的重要意義。另選用一對(duì)TCRβ通用性引物作為T(mén)CRγ多重引物的補(bǔ)充和比較,同時(shí)聯(lián)合最常用以及檢測(cè)率較高的FR3A和FR2A通用性引物檢測(cè)T-NHL中IgH基因的克隆性重排在本實(shí)驗(yàn)室T-NHL中的檢測(cè)率。我們研究趨化因子受體中Th1相關(guān)標(biāo)記CXCR3和Th2細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記CCR3在T-NHL中表達(dá)以評(píng)估其與臨床病理的關(guān)系。材料與方法1材料(1)T-NHL標(biāo)本:收集

10、1997-2008年我醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的T-NHL標(biāo)53例。全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片,除常規(guī)HE染色外,采用LCA(2B11,DAKO)、CD45RO(UCHL1,DAKO)、CD20(L26,DAKO)、CD30(Ber-H2,DAKO)免疫組化確定腫瘤的免疫表型。按照2001年WHO關(guān)于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有病例進(jìn)行分類:同時(shí)參照1992年Kail標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)高低級(jí)別分級(jí)。

11、(2)對(duì)照組標(biāo)本:收集反應(yīng)性增生的淋巴組織石蠟標(biāo)本4例,其中1例為淋巴結(jié),3例為扁桃體。(3)Jurkat細(xì)胞:人類T細(xì)胞白血病細(xì)胞株,培養(yǎng)條件:選擇RPMI1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2～95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合成簇,離心收集后待用。2方法(1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)T-NHL中LCA,CD45RO,CD20,CD30的表達(dá),確定腫瘤免疫表型。(2)選取6例T-NHL和4例反應(yīng)性增生的淋

12、巴組織,根據(jù)脫蠟時(shí)間與脫蠟溫度不同分為兩組,然后常規(guī)蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蠟組織DNA;TCRγ基因重排為研究對(duì)象,選用多重TCRγ引物,優(yōu)化PCR循環(huán)參數(shù)。(3)采用PCR方法,聯(lián)合TCRγ,TCRβ及FR3A、FR2A引物,檢測(cè)53例T-NHL標(biāo)本TCRγ、TCRβ及IgH基因克隆性重排,產(chǎn)物先2%瓊脂糖電泳初篩,后行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。(4)選擇Th1相關(guān)的細(xì)胞因子受體CXCR3和Th2相關(guān)的細(xì)胞因子受體CCR3,

13、運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)這兩種細(xì)胞因子受體在45例T-NHL中表達(dá)水平,評(píng)估其與臨床病理的關(guān)系。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果均使用SPSS16.0 for Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3結(jié)果(1)根據(jù)免疫組織化學(xué)分型、組織學(xué)改變以及臨床資料,同時(shí)參照2001年WHO關(guān)于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)53例T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類,分為27例外周T細(xì)胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U),12例腸病相關(guān)性T細(xì)胞淋巴瘤(ETTCL),8例間變性大細(xì)胞T

14、細(xì)胞淋巴瘤(ALCL),6皮下脂膜炎性T細(xì)胞淋巴瘤(SCPTCL)。(2)脫蠟時(shí)間長(zhǎng)和脫蠟溫度高的一組DNA質(zhì)量以及產(chǎn)量較高。(3)FFPE樣本TCRγ多重引物擴(kuò)增中:TCRγA,B管40個(gè)循環(huán)達(dá)到最佳擴(kuò)增效果;TCRγA管退貨溫度在50.9℃～65.5℃都可達(dá)到滿意的擴(kuò)增效果,而TCRγB管則需在50.9℃～56.7℃;TCRγA,B管所需引物量50pmol以上,Mg2+終濃度1.25～1.75 mM,dNTPs終濃度100～200

15、uM。(4)53例T-NHL中。采用優(yōu)化的TCRγA,B管多重引物克隆性TCRγ基因重排檢測(cè)率為62.3%(33/53),TCRβD2-J2通用性引物的檢洲率為41.9%(23/53),聯(lián)合TCRβ通用性引物,總檢測(cè)率為66.0%(35/53)。(5)聯(lián)合TCRγA,B管及FR3A、FR2A引物,7.6%(4/53)T-NHL檢測(cè)到雙重重排,免疫組化結(jié)果提示這4例均為T(mén)細(xì)胞表型。病理類型分別為3例外周T細(xì)胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U)

16、與1例間變形性大細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)。(6)免疫組化檢測(cè)45例T-NHL中CXCR3與CCR3表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR3與CCR3總的表達(dá)率為24.4%,不同病理類型之間表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。4結(jié)論(1)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間以及提高脫蠟溫度有助于提高FFPE樣本中DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。(2)對(duì)TCRγ多重引物增加PCR循環(huán)次數(shù)有助于提高劣質(zhì)DNA的擴(kuò)增率,增加引物濃度,輕微增加的Mg2+濃度結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)量dNTPs可以改善TC

17、Rγ基因的克隆檢測(cè)。(3)在TCRG多重引物優(yōu)化過(guò)程中,我們的實(shí)驗(yàn)有助于確定哪一個(gè)參數(shù)以及如何改變來(lái)減少假陽(yáng)性或假陰性。(4)采用優(yōu)化的TCRγA,B管多重引物,克隆性TCRγ基因重排在T-NHL中檢測(cè)率高于TCRβ通用性引物D2-J2,但聯(lián)合TCRβ通用性引物D2-J2,可以提高總檢測(cè)率。(5)基因重排與淋巴瘤細(xì)胞的免疫表型并不一致。不能通過(guò)基因重排來(lái)確定T、B細(xì)胞系來(lái)源,除非必須同時(shí)進(jìn)行Ig和TCR基因重排,排除其一才能確定其細(xì)胞系