人GRP78在CHO細胞中的表達及功能鑒定.pdf

1、背景與目的：
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是熱休克蛋白家族成員之一,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶。GRP78是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)中的主要調(diào)節(jié)劑,能阻止壓力性傳感器的活化、維護胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、結(jié)合促凋亡分子,從而減少細胞程序性死亡。GRP78在缺氧、低血糖、酸化等微環(huán)境應(yīng)激條件引起的壓力性應(yīng)激中起著重要的作用。近來有研究提示氧化應(yīng)激以及血清剝奪等微環(huán)境應(yīng)激條件與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力性應(yīng)激反應(yīng)有著密切的關(guān)系。課題組前期工作證明,增加糖調(diào)節(jié)

2、蛋白78(GRP78)在胰島β細胞的表達不僅可以保護胰島β細胞抵抗STZ誘導(dǎo)的凋亡,同時還可誘導(dǎo)免疫負調(diào) T細胞的形成,參與免疫調(diào)節(jié),但其機制尚不清楚。本實驗構(gòu)建人GRP78的真核表達質(zhì)粒,以及建立穩(wěn)定表達人GRP78的細胞系CHO-GRP78,研究氧化應(yīng)激、血清剝奪條件下,過表達的GRP78對CHO細胞凋亡以及存活率的影響,為進一步研究其在細胞凋亡以及免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.pIRES2-EGFP真

3、核表達載體的構(gòu)建
　　運用RT-PCR從胃癌細胞AGS中獲得人GRP78目的基因,以BamHⅠ為多克隆位點克隆至pIRES2-EGFP真核表達載體。
　　2.穩(wěn)定表達pIRES2-EGFP/GRP78的CHO細胞系的建立
　　用LipofectamineTM2000將pIRES2-EGFP/GRP78質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO細胞,經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,命名為CHO-GRP78。
　　3.CHO-GRP78細胞

4、中GRP78表達的鑒定
　　通過RT-PCR檢測GRP78 mRNA的表達。采用western blot檢測GRP78蛋白的表達;采用共聚焦顯微鏡和流式細胞術(shù)檢測GRP78蛋白的表達和分布。
　　4.細胞凋亡檢測
　　收集血清剝奪24h、48h的細胞,Annexin-APC和PI染色,FCM檢測細胞的凋亡。
　　5.MTT法測細胞存活率
　　細胞接種于96孔板培養(yǎng)24h,無血清培養(yǎng)24h使細胞同步化,然后以

5、濃度為200μM、400μM、500μM、600μM的H2O2處理細胞4h誘導(dǎo)細胞凋亡。加入MTT培養(yǎng)4h,用490nm的波長進行檢測。
　　結(jié)果：
　　1.酶切鑒定以及DNA序列分析結(jié)果顯示 GRP78克隆以及PIRES2-EGFP/GRP78表達載體構(gòu)建成功。
　　2.RT-PCR結(jié)果顯示CHO-GRP78中GRP78 mRNA表達水平高于CHO細胞;western blot顯示CHO-GRP78細胞總蛋白以及上清

6、中GRP78蛋白的表達量高于CHO細胞,且CHO-GRP78中GRP78蛋白表達的陽性率以及平均熒光強度均高于CHO細胞;共聚焦顯微鏡、流式細胞術(shù)檢測顯示GRP78主要定位于胞漿以及胞核中。
　　3.GRP78功能檢測
　　(1)過表達 GRP78對血清剝奪誘導(dǎo)的CHO細胞凋亡的影響:CHO、CHO-GRP78無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、48h后檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示,24h、48h時CHO-GRP78細胞存活率均高于CHO細胞

7、,48h時CHO-GRP78的損傷率低于CHO細胞。
　　(2)過表達GRP78對不同濃度H2O2作用下CHO細胞存活率的影響:結(jié)果顯示在200μM、400μM、500μM的H2O2作用下 CHO-GRP78細胞存活率高于CHO細胞,在雙氧水濃度為400μM時差異性最為顯著;并且在一定范圍內(nèi)隨著H2O2濃度的升高,細胞的存活率呈梯度性下降。
　　結(jié)論：
　　pIRES2-EGFP/GRP78真核表達載體構(gòu)建成功,并且在