抗人DR4多克隆抗體的制備及其誘導HeLa細胞凋亡的研究.pdf

1、誘導腫瘤細胞凋亡是多種癌癥治療方法之一。在癌癥治療中腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的死亡受體已經成為最具有潛力的治療靶位點之一。DR4(Death receptor4)是TNFR超家族成員之一,其分子中具有富含半胱氨酸的胞外結構域和胞內死亡結構域(death domain,DD)。DR4的膜外區(qū)與其配體TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)特異性結合后可激活效應分子天冬蛋白酶(cas

2、pase),引發(fā)凋亡信號途徑,最終導致腫瘤細胞凋亡。抗人DR4單克隆抗體能夠有效殺死腫瘤細胞,并對正常細胞無細胞毒作用,因而成為抗腫瘤抗體藥物研究和開發(fā)的熱點。但是單抗制備繁瑣且成本高,在臨床上尚難廣泛應用。而多克隆抗體制備簡單且價格便宜。因此我們制備了抗人DR4多克隆抗體,初步研究了人DR4多抗誘導HeLa細胞凋亡的效果。
　　 本文采用RT-PCR方法從HeLa細胞中成功克隆出人DR4胞外區(qū)域(eDR4),通過抗原表位分析選

3、擇胞外區(qū)域抗原特異性較高的部分序列,構建重組克隆載體pMD-eDR4,測序鑒定正確后構建原核重組表達載體pGEX-DR4并經IPTG誘導在大腸桿菌中獲得表達。經Western blot鑒定,證實pGEX-DR4所表達的是融合蛋白GST-DR4。然后采用親和層析法分離純化融合蛋白GST-DR4,再通過切膠、透析獲得高純度的融合蛋白GST-DR4。用GST-DR4作為免疫原免疫小鼠制備了抗人DR4多克隆抗體。經過Western blot、E

4、LISA方法鑒定獲得了高特異性、效價達1:12800的抗人DR4多克隆抗體。用制備好的抗人DR4多克隆抗體分別處理HeLa細胞和人主動脈平滑肌細胞(HASMC),發(fā)現(xiàn)HeLa細胞在形態(tài)上有明顯的變化,細胞皺縮趨于圓形,核碎裂,形成凋亡小體；而HASMC的形態(tài)無變化。MTT法檢測結果顯示DR4抗體處理后HeLa細胞的生長受到明顯抑制,并且隨著濃度的降低抑制率逐漸減小,將DR4抗體和DR5抗體同時處理細胞,發(fā)現(xiàn)二者具有協(xié)同作用,對細胞生長的