CBD-bFGF對(duì)小鼠放射性肺損傷的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、放射性肺損傷（Radiation-induced lung injury，RILI）是胸部放療后并發(fā)癥，臨床分為初期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化。近年來(lái)關(guān)于RILI的研究日益受到學(xué)者重視，因其發(fā)病機(jī)制未完全闡明，目前臨床上仍缺乏特別有效的治療方法。
　　基于堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic Fibroblast growth factor，bFGF）具有血管再生、創(chuàng)傷修復(fù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)再生等的生物學(xué)作用，目前重組bFGF已被

2、廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)、糖尿病潰瘍、脊髓損傷修復(fù)、帕金森綜合征及阿茲海默病等臨床治療。文獻(xiàn)報(bào)道bFGF可以促進(jìn)放射性損傷的修復(fù)[1][2]，也可能對(duì)放射性肺損傷有積極促損傷修復(fù)的生物學(xué)作用[3]。鑒于此，本課題采用人工修飾方法在bFGF肽鏈一端添加一個(gè)膠原蛋白結(jié)合域（collagen binding domain，CBD），構(gòu)建重組CBD-bFGF，并對(duì)小鼠放射性肺損傷的早期進(jìn)行干預(yù)，旨在探討 CBD-bFGF對(duì)小鼠放射性肺損傷的生物學(xué)作用

3、。
　　第一部分 CBD-bFGF在體外的生物學(xué)活性及釋放
　　目的：
　　比較膠原結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（colla ge n b ind ing do ma in-bas ic F ibrob la st growth factor，CBD-bFGF）和商品化堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）在生物學(xué)活性、膠原結(jié)合率及緩釋功能的等方面的差異。
　　方法：
　　采用CCK-8方法，檢測(cè)CBD-bFGF

4、促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞（HS-865）的增殖作用，并且和商品化bFGF作對(duì)照。將相同濃度的CBD-bFGF溶液和bFGF溶液與大小相近的膠原支架耦合，6小時(shí)后將膠原支架從細(xì)胞因子溶液中取出，用 BCA試劑盒（總蛋白定量測(cè)試盒）檢測(cè)溶液中細(xì)胞因子的濃度，計(jì)算出CBD-bFGF和bFGF與膠原蛋白的結(jié)合效率；在體外不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)算CBD-bFGF和bFGF從膠原里的釋放量，繪制釋放曲線。
　　結(jié)果：
　　在體外，CBD-bFGF促進(jìn)

5、細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性強(qiáng)于bFGF，與膠原支架的結(jié)合率高于bFGF。釋放曲線表明，bF GF的釋放速度高于CBD-bFGF，CBD-bFGF與膠原結(jié)合后具有明顯的緩釋效果。
　　結(jié)論：
　　CBD-bFGF可以高效地結(jié)合膠原蛋白，且具有明顯的緩釋功能，可發(fā)揮bFGF的促增殖作用。
　　第二部分 CBD-bFGF對(duì)小鼠放射性肺損傷早期的干預(yù)作用及其機(jī)制
　　目的：
　　探索CBD-bFGF對(duì)小鼠放射性肺損傷早期

6、的干預(yù)作用，并探討其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　C57BL/6J雌性小鼠隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組（A組，n=30只），輻射組（B組，n=50只），輻射后第1天給予 CBD-bFGF組（C組，n=60只），輻射后第7天給予CBD-bFGF組（D組，n=60只）。（1）小鼠放射性肺損傷模型的構(gòu)建；A組小鼠作為空白對(duì)照，B、C和D三組小鼠全胸接受X線直線加速器輻射，單次，14Gy。（2） CBD-bFGF對(duì)放射性肺損傷小鼠的干預(yù)

7、：C組小鼠于輻射后第1天、D組小鼠于輻射后第7天，分別氣管內(nèi)滴注CBD-bFGF（2ug/只）。所有小鼠于輻射后1周、2周、4周、8周、12周、16周、20周，觀察并檢測(cè)下列指標(biāo)：①小鼠體重變化；②小鼠外貌變化；③肺組織切片HE和Masso n染色；④免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠肺組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I型膠原蛋白（Collagen-I，Col-1）、III型膠原蛋白（Colla

8、gen-3，Col-3）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)。輻射后第20周時(shí)，取A、B、C和D四組各2只小鼠進(jìn)行肺部CT平掃和三維重建。
　　結(jié)果：
　　A組小鼠行動(dòng)自如，呼吸平穩(wěn)，飲食飲水正常，全身毛發(fā)光澤鮮亮。B、C、D三組小鼠輻射后第3天開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，呼吸頻率較前升高，進(jìn)食進(jìn)水量稍減少，在第2周時(shí)輻射野的毛發(fā)有少量變白；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠

9、輻射野毛發(fā)逐漸變白脫落，但輻射部位皮膚無(wú)明顯潰爛出血。
　　A組小鼠體重持續(xù)增加。B、C、D三組小鼠在輻射后體重均下降，在8周后體重下降速度放緩并出現(xiàn)體重回升，但在16周時(shí)體重又開(kāi)始下降。輻射后第16周、第20周后，C、D組小鼠較B組小鼠體重下降更明顯(P<0.05)。
　　肺組織HE、Masson染色顯示，與A組比較，B、C、D組小鼠早期有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織滲出增加，間質(zhì)炎癥改變，間隔增厚；并隨著時(shí)間的推移，后期肺組織結(jié)構(gòu)

10、破壞，肺間質(zhì)膠原纖維進(jìn)展性沉積，肺泡逐漸萎縮甚至消失，肺纖維化形成。C、D兩組與B組比較，給予CBD-bFGF后小鼠肺組織HE、Masson染色提示急性放射性肺炎并未減輕，反而在輻射后第16周、20周小鼠肺組織HE、Masso n染色提示肺纖維化加重（P<0.05）。
　　小鼠肺組織免疫組化檢測(cè)顯示，B、C、D三組與A組比較，小鼠肺組織中，α-SMA、Col-1、Co l-3、TGF-β1表達(dá)均顯著增多（P<0.001）；第20周

11、時(shí)，C、D組小鼠肺組織α-SMA、Co l-1、Col-3、TGF-β1的表達(dá)，較B組小鼠要明顯增高（P<0.05）；第20周時(shí)小鼠肺部CT掃描圖像和三維重建圖像表明，空白組小鼠肺部C T正常，而輻射組和干預(yù)組小鼠肺部表現(xiàn)為兩肺彌漫間質(zhì)性改變。
　　結(jié)論：
　　C57BL/6J小鼠胸部接受單次14Gy劑量輻射，能成功構(gòu)建放射性肺損傷動(dòng)物模型。放射性肺損傷小鼠早期給予 CBD-bFGF干預(yù)后，并沒(méi)有出現(xiàn)加快肺損傷修復(fù)效應(yīng)，反而