視神經脊髓炎及多發(fā)性硬化關聯基因FcRL3的表達研究.pdf

1、第一部分視神經脊髓炎及多發(fā)性硬化關聯基因FcRL3的表達研究
　　目的：
　　與疾病關聯的基因多態(tài)性可能增加了疾病發(fā)生發(fā)展的危險因素，但是更重要的是認識這種多態(tài)性位點如何改變基因及細胞的功能，從而進一步認識疾病的發(fā)病機制。在本課題組的前期研究中，我們發(fā)現 FcRL3基因多態(tài)性與中國漢族人群NMO和MS相關聯。在這部分，我們將進一步探討FcRL3基因多態(tài)性與NMO及MS患者發(fā)病的關系，特別是FcRL3基因表達與臨床用藥及患者病

2、程不同時期之間的關系；同時構建表達有FcRL3的體外模型Jurkat細胞，觀察NMO和MS的急性期治療藥物甲強龍對FcRL3表達水平的影響。初步探討FcRL3基因在NMO和MS發(fā)病過程中的可能機制。
　　方法：
　　1、收集臨床確診的MS組56例，NMO組57例以及正常對照77例。其中MS組中收集患者血液標本62份，包括部分患者不同用藥時期的外周血：急性期13例，緩解期5例；NMO組收集患者血液標本98份，其中部分患者采集不

3、同用藥時期的外周血：用藥前（急性期）、用藥中（急性期）、用藥后（緩解期），包括急性期67例，緩解期31例；正常對照的血液標本77份。采用逆轉錄聚合酶鏈反應和實時熒光定量PCR技術檢測患者及正常對照標本外周血FcRL3 mRNA的表達。
　　2、收集Jurkat細胞株，驗證Jurkat細胞株高表達FcRL3蛋白。采用逆轉錄聚合酶鏈反應檢測 Jurkat細胞株不同用藥時期 FcRL3 mRNA的表達；采用Western-blottin

4、g蛋白免疫印跡法檢測不同用藥時期Jurkat細胞株上 FcRL3蛋白的表達情況；流式細胞術分析檢測激素對Jurkat細胞上FcRL3表達的影響。
　　結果：
　　1、FcRL3 mRNA在患者中的表達量明顯低于正常對照FcRL3的表達量（p<0.05）；不管是在MS患者還是NMO患者。在NMO組中，患者急性期的表達量明顯低于在緩解期的表達量（p<0.05）。
　　2、在MS組中，不同基因型表達存在顯著的統(tǒng)計學差異，CC

5、基因型FcRL3 mRNA較其他基因型明顯增高（CC vs CT，P=0.014；CC vs TT，p=0.005），在NMO組中，不同基因型FcRL3mRNA表達存在著明顯差異（CT vs TT，p=0.038）；然而，在正常對照中，不同基因型的FcRL3 mRNA表達不存在統(tǒng)計學差異。對于相同基因型 TT，NMO組的FcRL3 mRNA表達明顯低于對照組（p=0.000），同時，MS組的FcRL3 mRNA表達明顯低于對照組（p=0

6、.001）；對于相同基因型CT，NMO組（p=0.004）和MS組（p=0.009）的FcRL3 mRNA表達明顯低于對照組；對于相同基因型CC，NMO組和MS組的FcRL3 mRNA表達與對照組相比沒有明顯統(tǒng)計學差異。
　　3、在NMO組中，可觀察到同一病人在激素不同用藥時期（用藥前—用藥中—用藥后）出現外周血FcRL3 mRNA表達不同趨勢，表現為使用激素后FcRL3表達抑制，緩解期FcRL3 mRNA表達升高的趨勢。

7、　　4、NMO患者病程的不同時期（急性期—緩解期），不同病程 FcRL3 mRNA表達存在明顯的統(tǒng)計學差異，緩解期較急性期 FcRL3基因表達明顯增高（p=0.045）；在MS組中，患者臨床病程的不同時期（急性期－緩解期），FcRL3 mRNA表達不存在統(tǒng)計學差異（p=0.297）。
　　5、經驗證Jurkat細胞上FcRL3蛋白高表達。Jurkat細胞上FcRL3蛋白的表達在不同濃度激素干預時有量的差異，在0.25mg甲強龍干預

8、水平，Jurkat細胞出現抑制但不致死，故0.25mg為最適用藥濃度。
　　7、Jurkat細胞在0.25mg激素干預的不同用藥時期（24h-48h），出現使用激素后FcRL3表達抑制，用藥后一定時間FcRL3 mRNA表達升高的趨勢。
　　結論：
　　1、FcRL3基因與中國漢族人群NMO和MS均具有相關性。
　　2、在中國漢族人群NMO和MS患者中，FcRL3基因 rs7528684位點作為啟動子及其近側區(qū)域

9、可結合控制轉錄起始的元件，影響外周血 FcRL3轉錄，從而調節(jié)FcRL3基因的表達。
　　3、外周血單個核細胞的FcRL3 mRNA在NMO和MS緩解期表達增高，推測其可能是一種保護性反應，具體機制有待進一步探討。
　　4、藥物干預后，Jurkat細胞上FcRL3表達呈劑量時間效應關系，推測FcRL3基因在免疫調節(jié)中的準確作用和在胞內信號通路中起著一定的作用。
　　第二部分ATG5基因多態(tài)性與中國南方漢族人群視神經脊髓

10、炎相關性的研究
　　目的：
　　視神經脊髓炎（Neuromyelitis Optica，NMO）和多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)為中樞神經系統(tǒng)慢性炎癥性脫髓鞘性的自身免疫性疾病。視神經脊髓炎，以往被視為多發(fā)性硬化的一種特殊亞型。自從NMO的自身特異性抗體NMO-IgG的發(fā)現，人們才把 NMO從 MS中獨立出來。近來，自噬相關基因5（autophagy-related gene,ATG5）發(fā)現與許多的

11、自身免疫性疾病和炎性疾病發(fā)病相關。ATG5在T細胞上表達的增加可能參與了MS病人的炎性脫髓鞘過程。然而目前國內外尚未見有關ATG5基因多態(tài)性與NMO及MS發(fā)病相關性的報道。本研究主要對自噬相關基因5(ATG5)基因多態(tài)性和視神經脊髓炎以及多發(fā)性硬化的疾病易感性進行探討。
　　方法：
　　收集2007-2012年復旦大學華山醫(yī)院和福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科住院及門診確診的視神經脊髓炎患者109例，多發(fā)性硬化患者144例,

12、健康對照288例，采用MassArray對病例組及健康對照組進行ATG5基因的5個SNP位點進行基因多態(tài)性分析。
　　結果：
　　1、NMO組rs548234的CC基因型與正常對照組相比具有明顯意義（P=0.016），同時進一步比較NMO-IgG陽性的NMO組與正常對照組，我們發(fā)現rs548234位點T等位基因（P=0.003）和rs6937876位點的A等位基因（P=0.003）是一種保護因素。MS組ATG5的5個SNP位

13、點的基因型和等位基因頻率與正常對照組相比較不存在明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）；
　　2、NMO組中，rs548234的CC基因型增加疾病易感性(p=0.016)；
　　3、在NMO-IgG(+)的NMO患者中,rs548234(p=0.003)位點的T等位基因和rs6937876(p=0.009)位點的A等位基因為其保護因素；
　　4、我們并沒有發(fā)現ATG5基因多態(tài)性與MS的發(fā)病存在相關性。
　　結論：