艾滋病毒Tat對HHV-8 K12基因誘導(dǎo)腫瘤形成的影響及其分子機制初探.pdf

1、本研究的目的:是探索人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1，又稱艾滋病毒)反式激活轉(zhuǎn)錄蛋白(transactivative transcription protein，Tat)對人類皰疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)K12基因誘導(dǎo)腫瘤形成的影響及其分子機制。 實驗首先構(gòu)建了含HHV-8 K12基因的重組質(zhì)粒K12-Flag-pcDN

2、A3.1(+)(命名為pK12F)，將其與本室保存Tat-Flag-pcDNA3.1(+)(命名為pTatF)質(zhì)粒單獨或共轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞(Swiss小鼠成纖維細胞)，同時以空載體pcDNA3.1(+)為對照，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的四株細胞，分別命名為N/K12、N/Tat、N/K12/Tat、N/pcDNA3.1。進而采用<'3>HTdR摻入實驗及流式細胞檢測法分別測定上述四株細胞的增殖能力和細胞周期。<'3>HTdR摻入實驗結(jié)果

3、顯示，四株細胞的增殖能力從高到低依次為N/K12/Tat、N/K12、N/pcDNA3.1、N/Tat(P<0.05)；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，四株細胞的S期細胞比率(S-phase fraction，SPF)從高到低的排序與<'3>HTdR摻入實驗結(jié)果一致。隨后，軟瓊脂集落形成實驗證實上述四株細胞均能體外誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化。將四株細胞分別進行裸鼠體內(nèi)成瘤實驗的結(jié)果表明，自分泌和近距離旁分泌Tat蛋白能加速HHV-8 K12誘導(dǎo)腫瘤的形成(Log

4、-rank檢驗，P<0.05)，遠距離旁分泌Tat蛋白不具備此功能(P>0.05)。為進一步探索Tat和K12相互作用的機制，采用基因芯片技術(shù)對這四株細胞及其對應(yīng)的腫瘤組織進行了與腫瘤形成相關(guān)15條信號通路96個標志物基因mRNA表達的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然細胞和組織結(jié)果存在差異，但均顯示出Tat能促使K12基因激活更多的腫瘤信號基因。Western blot檢測四株細胞中STAT3(signal transducer and activa

5、tor of transcription 3，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3)蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示Tat可以促進K12激活磷酸化STAT3的表達。免疫組化檢測裸鼠腫瘤組織中CyclinD1(周期蛋白D1)、VEGF(vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮細胞生長因子)和Survivin(存活素)的結(jié)果表明Tat能降低這些蛋白在K12誘導(dǎo)的腫瘤中的表達。 本研究結(jié)果提示，在體外Tat能增強K