HBV特異性細胞免疫與樹突狀細胞蛋白酶體功能相關(guān)性實驗研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染的過程中，HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是清除病毒的關(guān)鍵因素，而樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)作為專職抗原遞呈細胞(Antigen presenting cells，APCs)，對CTL的誘導(dǎo)又起著決定性的作用；正常功能的DC對乙型肝炎患者的病情進展、血清轉(zhuǎn)化乃至預(yù)后都有著重要影響。但是，在乙型肝炎尤其是慢乙肝患者，DCs數(shù)量和功能均呈下降趨勢。DCs為何會發(fā)生數(shù)量減少和功能降低

2、至今仍未完全闡明。近年來有相關(guān)文獻報道了慢性病毒感染會減弱所在細胞的蛋白酶體功能，如HIV、HSV等(1，2)。受此啟發(fā)，我們的實驗對乙肝慢性化過程中HBV復(fù)制與DCs的蛋白酶體功能做了一系列的臨床和基礎(chǔ)研究，以期為打破慢乙肝患者體內(nèi)免疫耐受、誘導(dǎo)有效細胞免疫提供新的思路。全文共分三章：
　　 第一章.慢乙肝患者DCs蛋白酶體功能分析
　　 1.目的
　　 優(yōu)化人單核細胞源性樹突狀細胞(MoDCs)分離誘導(dǎo)方法，

3、探討慢乙肝患者體內(nèi)樹突狀細胞蛋白酶體功能變化情況。
　　 2.材料和方法
　　 應(yīng)用連續(xù)貼壁法及磁珠法分離培養(yǎng)人單核細胞源性樹突狀細胞(MoDC s)，誘導(dǎo)成熟后經(jīng)流式細胞儀檢測細胞表面標志(CD80，CD86，HLA-DR)，比較兩種方法及不同誘導(dǎo)因素對DCs分化的影響。
　　 分離誘導(dǎo)慢乙肝患者的MoDCs，分析其蛋白酶體相關(guān)亞基表達及蛋白降解活性。
　　 3.結(jié)果
　　 流式細胞儀檢測結(jié)果顯

4、示，兩種分離方式誘導(dǎo)的MoDCs表面HLA-DR、CD83、CD86表達水平相差甚微；但磁珠分離法所得MoDCs純度較高。以TNF-α和HBcAg分別誘導(dǎo)樹突狀細胞成熟，誘導(dǎo)后MoDCs的HLA-DR、CD83、CD86水平明顯高于未加誘導(dǎo)劑組，但TNF-α和HBcAg誘導(dǎo)的組間差距不大。
　　 實驗結(jié)果顯示，相對于正常對照組，慢乙肝患者的MoDC免疫蛋白酶體亞基LMP2、LMP7表達率明顯下降，且蛋白酶體功能出現(xiàn)下調(diào)；而蛋白酶

5、體功能下降程度與患者ALT及HBV DNA水平無顯著相關(guān)性。
　　 4.結(jié)論
　　 采用磁珠分離法可獲得純度較高的MoDCs，來源廣泛，獲取簡單。所得DCs在體外培養(yǎng)的條件下可以穩(wěn)定存在1w左右。流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示MoDCs表面特征分子表達明顯，細胞狀態(tài)較好，完全可以滿足下游實驗的需要。
　　 臨床試驗顯示慢乙肝患者體內(nèi)DCs蛋白酶體功能下調(diào)，免疫蛋白酶體亞基LMP2、LMP7合成受阻，提示DCs蛋白酶體功能

6、異?？赡芘c慢乙肝患者免疫耐受發(fā)生有關(guān)。
　　 第二章.HBV復(fù)制導(dǎo)致DC蛋白酶體功能下調(diào)的機制研究
　　 1.目的
　　 構(gòu)建HBV全基因真核表達質(zhì)粒pCDNA-HBV-EGFP，采用脂質(zhì)體和電轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MoDCs并得以表達。觀察HBV基因復(fù)制及相關(guān)蛋白合成對MoDCs蛋白酶體功能的影響。
　　 2.材料與方法
　　 擴增HBV全基因并將其克隆至帶有報告基因EGFP的pCDNA3.1質(zhì)粒中，構(gòu)

7、建能夠表達HBV全基因的真核表達質(zhì)粒pCDNA-HBV-EGFP，酶切鑒定。
　　 以磁珠法分離誘導(dǎo)MoDCs，誘導(dǎo)成熟后分別以脂質(zhì)體法和微量電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染pCDNA-HBV-EGFP入MoDCs，觀察HBV基因復(fù)制和病毒相關(guān)蛋白表達對MoDCs的蛋白酶體功能的影響。
　　 3.結(jié)果
　　 成功構(gòu)建可以表達HBV全基因的真核表達質(zhì)粒pCDNA-HBV-EGFP，雙酶切鑒定顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功。運用脂質(zhì)體及微量電轉(zhuǎn)法兩種方

8、式轉(zhuǎn)染改質(zhì)粒入MoDCs，轉(zhuǎn)染后RT-PCR、western blot、綠色熒光蛋白以及免疫熒光結(jié)果顯示HBV在MoDCs內(nèi)得到較高程度表達；而隨著HBV基因復(fù)制和相關(guān)蛋白成分表達，MoDCs的蛋白酶體活性呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，表現(xiàn)為免疫蛋白酶體亞基LMP2、LMP7表達下降，同時MoDCs刺激同種異體T細胞增殖及細胞因子分泌能力也較對照組降低。
　　 4.結(jié)論
　　 所構(gòu)建pCDNA-HBV-EGFP真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MoDC

9、s可有效表達HBV相關(guān)蛋白，而HBV復(fù)制可下調(diào)MoDCs的蛋白酶體亞基生成，并抑制蛋白酶體的正常功能。
　　 第三章.蛋白酶體功能抑制對乙肝病毒復(fù)制的影響
　　 1.目的
　　 以不同劑量的蛋白酶體抑制劑MG132、Epoxomicin干預(yù)HepG2.2.15，以MTT法檢測蛋白酶體抑制劑MG132和Epoxomicin對HepG2.2.15細胞的毒性。在此基礎(chǔ)上選取合適劑量觀察蛋白酶體抑制劑對HBV基因復(fù)制和蛋

10、白表達的影響，探討以蛋白酶體做為新的靶點抑制HBV復(fù)制的可行性。
　　 2.材料和方法
　　 優(yōu)化HepG2.2.15細胞培養(yǎng)及傳代條件，以不同劑量的蛋白酶體抑制劑MG132、Epoxomicin干預(yù)HepG2.2.15。得出IC50值，在此基礎(chǔ)上以RT-PCR、westernblot、免疫熒光技術(shù)判斷蛋白酶體抑制劑對HBV基因復(fù)制和蛋白表達的影響。
　　 3.結(jié)果
　　 MG132和Epoxomicin

11、作用的HepG2-2.215細胞上清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg均有明顯下降，且對胞內(nèi)HBcAg的生成也有一定的抑制作用；抑制程度隨著蛋白酶體抑制劑濃度的增加而呈遞增趨勢，表現(xiàn)出較好的劑量依賴性和抑制效率。
　　 4.結(jié)論
　　 蛋白酶體抑制劑MG132、Epoxomicin可有效抑制HepG2.2.215細胞中HBV的基因復(fù)制及病毒抗原的表達；此外，蛋白酶體抑制劑對于HBcAg介導(dǎo)的核衣殼包裝也有一定的抑制