腫瘤轉移相關因子在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結轉移灶中的表達及臨床意義.pdf

1、目的：喉聲門上型癌、喉咽癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤，區(qū)域淋巴結是否有轉移是影響喉聲門上型癌、喉咽癌治療和預后的關鍵因素。目前比較肯定的與喉聲門上型癌、喉咽癌轉移有關的因素有：局部生長擴散程度、部位、T分級和病理類型。研究發(fā)現腫瘤轉移與誘導基因組的不穩(wěn)定性有關，這種不穩(wěn)定性在表達各種不同類型的腫瘤中產生許多亞群、克隆和亞克隆。同一腫瘤中腫瘤細胞出現異質性，即多樣性和亞群。通過侵襲方式進入機體循環(huán)系統的腫瘤細胞絕大部分在短期內死亡，

2、只有具有高度轉移潛能的腫瘤才能逃逸種種因素，通過循環(huán)系統到達繼發(fā)臟器，最終增殖生長形成轉移灶。但是腫瘤細胞進入繼發(fā)臟器基質并不意味轉移一定形成，只有當侵入繼發(fā)臟器基質的腫瘤細胞增殖形成轉移腫瘤灶并進行性長大才真正實現癌轉移。研究表明，在腫瘤的演變和進展過程中，腫瘤克隆形成時出現的遺傳性變異連同宿主的選擇壓力可導致具有優(yōu)勢生長的新亞系出現，腫瘤異質性和不同腫瘤細胞亞群具有不同轉移特性的觀點已經得到公認。研究發(fā)現多種參與腫瘤轉移過程的基因表

3、達產物與腫瘤淋巴結轉移密切相關，如與細胞黏附相關的CD44、上皮鈣依賴粘附素(E-Cadherin，E-Cad)；與轉移侵襲相關的如血管內皮生長因子-C(VEGF-C)、基質金屬蛋白酶9(Matrixmeoalloprotase9，MMP-9)；參與腫瘤轉移調控的基因nm23-H1以及新近發(fā)現的轉移信號分子開關蛋白PINCH等，均可作為判定腫瘤細胞轉移潛能的參考指標。本研究將從轉移基因調控、腫瘤黏附、惡性浸潤三個方面，應用免疫組織化學方

4、法和流式細胞儀檢測方法，探討各種不同腫瘤轉移相關基因編碼蛋白在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶和淋巴結轉移灶腫瘤細胞中的表達規(guī)律及其臨床意義，從而為喉聲門上型癌、喉咽癌轉移潛能及預后判定提供參考依據。 方法：標本選自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科2001年1月1日—2004年12月31日術前未經治療的喉聲門上型癌、喉咽癌41例病人，其中喉聲門上型癌22例，喉咽癌19例；41例患者術后均經病理證實有淋巴結轉移；男38例，女3例；中位年齡56

5、歲(43～72歲)。根據國際抗癌協會(UICC)標準(2002)確定TNM分期。臨床分期：Ⅲ期12例、Ⅳ期29例。41例均為鱗狀細胞癌，病理學分級：Ⅰ級8例，Ⅱ級22例、Ⅲ級11例。所有病例腫瘤原發(fā)灶和淋巴結轉移灶用于常規(guī)病理、免疫組化和流式細胞學檢測。標本離體后2小時內放入10％中性福爾馬林中固定24小時，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，所有標本均經兩位副高職以上的病理科醫(yī)生確定病理性質和病理學分級。 采用S-P法對石蠟切片進行免疫組

6、織化學染色，觀察指標為PINCH、nm23-H1、CD44、E-Cad、VEGF-C、MMP-9。結果判定：每例標本以400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數每個視野中100個腫瘤細胞中的陽性細胞數，取其平均數求其陽性百分率作為結果。平均陽性細胞所占比例≤5％判定為陰性，陽性染色細胞＞5％判定為陽性。PINCH主要表達于細胞間質和/或胞漿、胞核；nm23-H1和VEGF主要表達于胞漿；CD44主要表達于細胞膜；E-Cad和MMP-9主要表

7、達于細胞膜和/或胞漿。 流式細胞術觀察指標為PINCH、nm23-H1、CD44、E-Cad、VEGF-C、MMP-9，取石蠟標本切片(40μm厚)，網搓法制備單細胞樣品。在對蛋白免疫熒光標記物測定時，設一抗或二抗的本底對照和陰性對照。采用美國BeckmanCoulter公司生產的Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行檢測。以熒光指數(FI)表示蛋白表達產物的相對含量，FI=(瘤細胞表達的平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度)。熒

8、光指數(FI)可相對客觀的反映蛋白的表達程度。 結果：1.轉移調控相關蛋白PINCH、nm23-H1在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結轉移灶中的表達(1)原發(fā)灶腫瘤PINCH蛋白陽性率為70.7％，轉移灶腫瘤陽性率為90.2％，兩者比較統計學差異有顯著性(P＜0.05)；原發(fā)灶腫瘤nm23-H1蛋白表達陽性率為34.1％，轉移灶腫瘤陽性率為26.8％，兩者比較統計學差異無顯著性(P＞0.05)。原發(fā)灶腫瘤PINCH蛋白表達與

9、喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級密切相關(P＜0.05)，臨床分期越晚、病理分化程度越低，PINCH蛋白表達陽性率及表達強度越高；而nm23-H1原發(fā)灶腫瘤蛋白表達與喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級未見相關關系(P＞0.05)。 (2)流式細胞檢測原發(fā)灶與轉移灶腫瘤細胞PINCH蛋白表達的相對含量的平均熒光指數(FI)分別為1.32±0.17和1.56±0.18，統計學分析發(fā)現兩者間差異有顯著性(p＜0.05)。流式

10、細胞檢測原發(fā)灶與轉移灶腫瘤細胞nm23-H1蛋白表達的相對含量的平均熒光指數(FI)分別為1.11±0.19和1.08±0.15，統計學分析發(fā)現兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。 (3)Pearson相關檢驗分析表明喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶與其淋巴結轉移灶中PINCH、nm23-H1表達均呈負相關(P＜0.05)。 2.黏附相關因子CD44和E-cad蛋白在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結轉移灶中的表達(1)原發(fā)

11、灶腫瘤CD44蛋白表達陽性率為75.1％，轉移灶腫瘤陽性率為85.4％，兩者比較統計學差異無顯著性(P＞0.05)；原發(fā)灶腫瘤E-Cad蛋白表達陽性率為31.7％，轉移灶腫瘤陽性率為26.8％，兩者比較統計學差異無顯著性(P＞0.05)。原發(fā)灶腫瘤CD44和E-cad蛋白表達與喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級均未見相關(P＞0.05)。 (2)流式細胞檢測原發(fā)灶與轉移灶腫瘤細胞CD44蛋白表達的相對含量的平均熒光指數(FI

12、)分別為1.33±0.16和1.27±0.18，統計學分析發(fā)現兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。流式細胞檢測原發(fā)灶與轉移灶腫瘤細胞E-Cad蛋白表達的相對含量的平均熒光指數(FI)分別為1.09±0.17和1.06±0.15，統計學分析發(fā)現兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。 (3)原發(fā)灶及淋巴結轉移灶CD44陽性病例中，E-cad的陽性率(32.3％，22.9％)均低于CD44陰性的病例(90％，66.7％)，經X2檢驗(P

13、＜0.05)，表明CD44與E-cad在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結轉移灶的表達均呈負相關。 3.腫瘤侵襲相關因子VEGF-C和MMP-9在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結轉移灶中的表達(1)原發(fā)灶腫瘤VEGF-C蛋白表達陽性率為90.2％，轉移灶腫瘤陽性率為92.7％，兩者比較統計學差異無顯著性(P＞0.05)；原發(fā)灶腫瘤MMP-9蛋白表達陽性率為80.5％，轉移灶腫瘤陽性率為85.4％，兩者比較統計學差異無顯著性

14、(P＞0.05)。原發(fā)灶腫瘤VEGF-C和MMP-9蛋白表達與喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級均未見相關(P＞0.05)。 (2)流式細胞檢測原發(fā)灶與轉移灶腫瘤細胞VEGF-C蛋白表達相對含量的平均熒光指數(FI)分別為1.33±0.15和1.29±0.15，統計學分析發(fā)現兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。流式細胞檢測原發(fā)灶與轉移灶腫瘤細胞MMP-9蛋白表達的相對含量的平均熒光指數(FI)分別為1.30±0.17和1.3

15、1±0.22，統計學分析發(fā)現兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。 (3)Person相關分析結果顯示，喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶與其淋巴結轉移灶VEGF-C和MMP-9蛋白表達之間均呈正相關(p＜0.05)。 結論：nm23-H1、CD44、E-Cad、VEGF-C、MMP-9在喉聲門上型癌和喉咽癌原發(fā)灶和淋巴結轉移灶腫瘤細胞中表達陽性率和表達強度未見差異，但轉移灶PINCH蛋白的表達陽性率和表達強度顯著高于原發(fā)灶，而且