非小細(xì)胞肺癌中PD-L1的表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　肺癌是世界上發(fā)病率最高的實(shí)體瘤之一，而其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）又占據(jù)了大部分比例。雖然針對(duì)NSCLC的治療方法如傳統(tǒng)手術(shù)、基于鉑類藥物的化療以及放療等都有迅速的發(fā)展，但是進(jìn)展期及發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC患者仍舊預(yù)后不良。因此，著力探索更新更有效的臨床治療策略是一個(gè)亟待解決的問題。
　　現(xiàn)今，靶向表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的治療藥酪氨酸激酶抑制劑（TKI）吉非替尼和厄洛替尼已經(jīng)成為了治療存在EGFR突變N

2、SCLC患者的一線藥物。同時(shí)，靶向免疫“檢查點(diǎn)”如PD-1、PD-L1和CTLA-4的治療藥也已經(jīng)被報(bào)道能顯著延長(zhǎng)腫瘤患者的中位無進(jìn)展生存期。但是，如何設(shè)計(jì)更合理的治療策略以及如何聯(lián)合以上兩種新治療措施以達(dá)到更好療效仍舊所知甚少。
　　最近有研究發(fā)現(xiàn)，具有EGFR突變的NSCLC細(xì)胞株會(huì)比具有其它突變類型的細(xì)胞株表達(dá)更高水平的PD-L1，但是其潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制未有報(bào)道。
　　本課題著力于尋找不同NSCLC細(xì)胞株EGFR突變狀態(tài)

3、和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性并考察EGFR-TKIs對(duì)EGFR-TKI敏感型以及獲得性耐藥型兩種NSCLC細(xì)胞株在體內(nèi)及體外模型中的影響，同時(shí)探討該作用的相關(guān)機(jī)制。因此，該項(xiàng)工作能夠?yàn)榕R床抗腫瘤免疫治療的完善提供新的策略。
　　方法：
　　1.NSCLC細(xì)胞株EGFR突變狀態(tài)和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性分析
　　提取NSCLC細(xì)胞株的總DNA并用PNA-LNA PCR檢測(cè)EGFR突變狀態(tài)。流式細(xì)胞分析檢測(cè)NSCLC細(xì)胞株的PD

4、-L1表達(dá)水平。在NSCLC細(xì)胞株的培養(yǎng)環(huán)境中加入人源性重組EGF并用流式細(xì)胞分析和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其PD-L1的表達(dá)。
　　2.EGFR-TKIs對(duì)EGFR-TKI敏感型和獲得性耐藥型NSCLC細(xì)胞株P(guān)D-L1表達(dá)的影響
　　體外實(shí)驗(yàn)部分，在NSCLC細(xì)胞株培養(yǎng)環(huán)境中加入不同劑量梯度（0、2.5、5、10、100nM）的吉非替尼刺激一定時(shí)間（48小時(shí)）或者加入同一劑量（100nM）吉非替尼刺激不同時(shí)間（0、6、12、24

5、、48小時(shí)），通過流式細(xì)胞分析和免疫熒光檢測(cè)其PD-L1的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，裸鼠皮下注射 NSCLC細(xì)胞株，待腫瘤長(zhǎng)至一定大小給予吉非替尼灌胃治療，之后測(cè)量腫瘤的體積和重量以及用流式細(xì)胞分析和免疫熒光檢測(cè)腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)水平。
　　3. NSCLC細(xì)胞株中EGFR介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)上調(diào)過程的機(jī)制研究
　　體外實(shí)驗(yàn)部分，用Western Blotting檢測(cè)不同NSCLC細(xì)胞株中NF-κB p65在胞漿和胞核的表

6、達(dá)水平。用不同劑量(0、50、100μM)的NF-κB抑制劑PDTC刺激NSCLC細(xì)胞株一段時(shí)間并用流式細(xì)胞分析檢測(cè)其PD-L1表達(dá)。在NSCLC細(xì)胞株培養(yǎng)環(huán)境中用不同劑量（0、2.5、5、10、100nM）吉非替尼刺激一段時(shí)間，用Western Blotting分別檢測(cè)其胞漿和胞核NF-κB p65的表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，在上述的吉非替尼治療的裸鼠荷瘤模型中，用免疫熒光檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中NF-κB p65的表達(dá)水平。
　　

7、結(jié)果：
　　1.NSCLC細(xì)胞株中EGFR活化水平和PD-L1表達(dá)相關(guān)
　　PNA-LNA PCR發(fā)現(xiàn)NSCLC細(xì)胞株P(guān)C-9、HCC827和H1650具有EGFR基因第19號(hào)外顯子的突變而H460、H1299和SPC-1A的EGFR基因無突變。流式細(xì)胞分析顯示EGFR突變型細(xì)胞株的PD-L1比EGFR野生型細(xì)胞株的PD-L1表達(dá)更高。流式細(xì)胞分析和定量PCR顯示外源性rhEGF刺激EGFR野生型細(xì)胞株后能有效上調(diào)其PD-L

8、1的表達(dá)。
　　2.吉非替尼能夠可逆性降低EGFR突變型NSCLC細(xì)胞株P(guān)D-L1的表達(dá)，且該作用具有濃度和時(shí)間依賴性
　　流式細(xì)胞分析和免疫熒光顯示不同濃度的吉非替尼刺激PC-9和HCC827一段時(shí)間或者一定濃度吉非替尼刺激PC-9和HCC827不同持續(xù)時(shí)間都能降低其PD-L1的表達(dá)水平，且降低程度與藥物作用的濃度及時(shí)間呈正相關(guān)。同時(shí)，流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)撤去吉非替尼的刺激或者同時(shí)加入外源性rhEGF能夠恢復(fù)吉非替尼預(yù)處理的P

9、C-9細(xì)胞株P(guān)D-L1的表達(dá)水平。
　　3.吉非替尼能夠降低EGFR-TKI獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞株的PD-L1表達(dá)，并且該作用具有濃度和時(shí)間依賴性
　　流式細(xì)胞分析顯示吉非替尼也能夠有效降低吉非替尼獲得性耐藥PC-9細(xì)胞株P(guān)D-L1的表達(dá)，并且PD-L1降低程度與吉非替尼作用的濃度和持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。
　　4.在PC-9細(xì)胞株異種種植裸鼠模型中，吉非替尼的治療能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)并且降低腫瘤組織PD-L1的表達(dá)水平<

10、br>　　吉非替尼治療能夠有效減少裸鼠PC-9皮下種植瘤的體積和重量。同時(shí)，流式細(xì)胞分析和免疫熒光顯示吉非替尼治療組裸鼠腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)水平比對(duì)照組腫瘤組織的表達(dá)水平明顯升高。
　　5.NF-κB通路參與EGFR-TKI對(duì)PD-L1的調(diào)控過程
　　Western Blotting結(jié)果顯示，相較于EGFR突變型NSCLC細(xì)胞株，在EGFR野生型細(xì)胞株中NF-κB p65在胞漿的表達(dá)水平更高而在胞核的表達(dá)水平更低。流式

11、細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑PDTC處理PC-9細(xì)胞株其PD-L1的表達(dá)水平明顯升高且升高程度依賴于PDTC的劑量。Western Blotting顯示不同濃度的吉非替尼刺激PC-9細(xì)胞株嫩能夠升高NF-κB p65胞漿表達(dá)并降低NF-κB p65胞核表達(dá)且改作用具有濃度依賴性，但吉非替尼對(duì)H1299細(xì)胞株NF-κB p65的表達(dá)無影響。PC-9細(xì)胞株裸鼠異種種植模型中，免疫熒光顯示吉非替尼灌胃治療也能夠降低腫瘤組織中NF-κB p65

12、的核表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. PD-L1在EGFR突變型NSCLC細(xì)胞株中高表達(dá)并且其在EGFR野生型細(xì)胞株中的表達(dá)受EGFR信號(hào)調(diào)控。
　　2. EGFR-TKI能夠有效降低EGFR-TKI敏感型以及EGFR-TKI獲得性耐藥型NSCLC細(xì)胞株中PD-L1的表達(dá)水平，并且該作用具有藥物濃度及時(shí)間依賴性。
　　3. EGFR-TKI治療能抑制腫瘤生長(zhǎng)并降低腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)。
　　4. EGFR