血管緊張素Ⅱ受體反義核酸轉(zhuǎn)染心肌細胞的研究.pdf

1、該研究以體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞為實驗模型,通過觀察轉(zhuǎn)染過程中AT1-AS-ODNs在心肌細胞內(nèi)的時相分布特點,轉(zhuǎn)染效率及細胞毒效應,探討AT1-AS-ODNs轉(zhuǎn)染心肌細胞的可能性;同時檢測AT1-AS-ODNs轉(zhuǎn)染后,對AT1基因表達的抑制效應;并探討在缺乏或存在外源性過度生長刺激的條件下,封閉AT1表達對心肌細胞生理、病理生長的影響.方法:該研究應用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合分段消化法分離心肌細胞,采取差速貼壁的方法對心肌細胞進行純化,原代

2、培養(yǎng),建立細胞模型.免疫細胞化學技術(shù)進行α-Sarcomeric actin染色,鑒定心肌細胞純度.以脂質(zhì)體為傳遞體系,攜帶AT1-AS-ODNs轉(zhuǎn)染心肌細胞.顯微熒光技術(shù)監(jiān)測AT1-AS-ODNs在心肌細胞內(nèi)的時相分布及轉(zhuǎn)染效率.MTT法結(jié)合倒置相差顯微鏡分析轉(zhuǎn)染復合物對心肌細胞的細胞毒作用;蛋白印跡技術(shù)檢測AT1-AS-ODNs進入心肌細胞后對靶基因的抑制效應.流式細胞儀檢測心肌細胞周期分布、細胞內(nèi)DNA合成及凋亡百分率;免疫沉淀技

3、術(shù)檢測細胞內(nèi)p46JNK、p54JNK活性;免疫細胞化學檢測核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白表達水平;放免法檢測細胞內(nèi)心鈉素(Atrial natriuretic factor,ANP)合成、分泌情況.結(jié)論:第一部分AT1-AS-ODNs能成功轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞.AT1-AS-ODNs單獨轉(zhuǎn)染時,轉(zhuǎn)染效率較低,在靶位點(主要是細胞核內(nèi))停留時間較短.陽離子脂質(zhì)體的中介能增加心肌細胞對寡核苷酸的攝入效率,促進ODNs快速的進入細胞核,并較

4、長時間的穩(wěn)定在細胞核內(nèi).該實驗所用轉(zhuǎn)染復合物無明顯的細胞毒性,不影響心肌細胞的活力.第二部分AT1-AS-ODNs能夠有效封閉AT1基因表達;這種抑制效應的發(fā)揮是源于反義序列設計的特異性,作用機制與傳統(tǒng)的AT1拮抗劑(替米沙坦)不同.第三部分在缺乏外源性過度生長刺激的條件下,AT1-AS-ODNs封閉AT1表達并不影響心肌細胞的存活及正常生長.第四部分AngⅡ(10-6mol/L)刺激不足以促使心肌細胞再次進入細胞周期進行有絲分裂,只誘