FCM與AgNORs在診斷Wistar大鼠腭黏膜癌變過程中的實驗研究.pdf

1、背景
　　 口腔癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占第六位。而口腔癌中最多的是鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)，占90％以上?？谇击[狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個漸進(jìn)的過程，從正?？谇火つぐl(fā)展到口腔癌，組織學(xué)上需要經(jīng)過上皮單純性增生、上皮異常性增生、原位癌、浸潤癌等階段?；颊呔驮\時一般已經(jīng)到達(dá)癌癥晚期，雖然可以應(yīng)用手術(shù)、化療以及放療等手段取得療效，但對于患者已經(jīng)造成不可修復(fù)的損傷

2、，破壞口腔頜面部的組織和功能，嚴(yán)重的傷害到病人的生理和心理的健康。因此，如何早期發(fā)現(xiàn)口腔黏膜的異常并針對其改變做到早期治療尤為重要，也是口腔癌研究方向上的一個重點。
　　 流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)起源于20世紀(jì)70年代，它是對單細(xì)胞定量分析的一種新技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)現(xiàn)在運(yùn)用最為廣泛的領(lǐng)域有免疫學(xué)，血液學(xué)，腫瘤學(xué)及細(xì)胞凋亡學(xué)等。流式細(xì)胞儀可以檢測DNA含量以及惡變細(xì)胞的異倍體。把瘤體組織解聚離散，制備成單細(xì)

3、胞懸液，然后用熒光染料嵌入DNA，使DNA顯影，通過計算機(jī)對細(xì)胞DNA的含量進(jìn)行分析。正常的體細(xì)胞都是二倍體，但腫瘤中常常會出現(xiàn)異倍體，包括四倍體及非整倍體，腫瘤的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)會發(fā)生異常，產(chǎn)生細(xì)胞增殖失控，這是惡性腫瘤的一個重要特征。有許多學(xué)者報道，流式細(xì)胞儀診斷惡性腫瘤的正確率高達(dá)90％以上。
　　 惡性腫瘤的標(biāo)志之一就是細(xì)胞無限增殖。核仁組織區(qū)(NOR)是位于染色體上的DNA片段，含有rRNA基因，能夠參與細(xì)胞核的形成，

4、并且是rRNA轉(zhuǎn)錄活動的標(biāo)志，能夠反映細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和功能的改變。核仁組織區(qū)含有核仁形成區(qū)嗜銀蛋白，能與銀離子結(jié)合并顯色，能通過計算機(jī)計數(shù)很好的判定細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
　　 目的
　　 本實驗采用化學(xué)方法誘導(dǎo)大鼠口腔癌模型，再結(jié)合流式細(xì)胞儀和銀染核仁組織區(qū)的方法進(jìn)行輔助診斷，并對這兩種方法進(jìn)行評價，尋求一種更為有效的檢測口腔黏膜癌變的方法，為人類口腔癌的早期診斷打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.建立動物模型

5、，實驗組63只Wistar大鼠平均分配，每籠7只，共9籠。用棉簽蘸取0.5％4NQO水溶液涂抹腭部黏膜，每隔一天涂一次，連續(xù)涂28周。對照組不做任何處理，從實驗開始第4，8，12，16，20，24，28周各從實驗組中隨機(jī)處死9只大鼠，同時處死一只對照組大鼠。
　　 2.在建模過程中，從第4周開始，每次處死動物前，用細(xì)胞刷刷取大鼠腭部可疑病變區(qū)，收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，做流式細(xì)胞術(shù)檢測。隨后處死動物，切取腭部組織，放到福爾馬林液中

6、固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，做HE染色，樹膠封片，顯微鏡觀察。另取一張切片做硝酸銀染色，做銀染核仁組織區(qū)顆粒計數(shù)。
　　 3.判斷標(biāo)準(zhǔn)：
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測判斷標(biāo)準(zhǔn)：以正常大鼠腭部口腔黏膜為參照，其細(xì)胞DNA為二倍體，DNA指數(shù)為1.0，由計算機(jī)軟件獲得實驗組各樣本DNA指數(shù)，在1.0±0.1之外的數(shù)字，表示該樣本含有DNA異倍體，異倍體率也有計算機(jī)軟件自動生成。
　　 大鼠口腔黏膜病變判斷標(biāo)準(zhǔn)：大

7、鼠口腔黏膜病理改變上皮異常增生和口腔癌的分級參照WHO(1996，1997)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 銀染核仁組織區(qū)判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照1995年11月“關(guān)于核仁組織區(qū)(AgNOR)研究工作的標(biāo)準(zhǔn)化方案”計數(shù)每個細(xì)胞核內(nèi)銀染顆?？倲?shù)，然后換算成每個細(xì)胞核AgNOR的平均數(shù)，同時在進(jìn)行核內(nèi)顆粒形態(tài)觀察。
　　 4.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，取α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。并對兩種實驗方法做線性相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果

8、：
　　 1.動物模型的建立：隨著致癌劑涂抹時間的延續(xù)，大鼠腭部黏膜相繼產(chǎn)生白色增厚、顆粒樣增生、潰瘍、糜爛等改變。第4周大鼠黏膜均為上皮單純性增生；第8周55.6％為單純增生，44.4％的大鼠為輕度異常增生；到第12周，有22.2％的大鼠腭部黏膜為輕度異常增生，55.6％的是中度異常增生，還有22.2％的是重度異常增生；到第16周有44.4％的大鼠腭部黏膜為中度異常增生，55.6％的為重度異常增生；第20周11.1％為中度異常

9、增生，77.8％為重度異常增生，11.1％為原位癌；第24周55.6％為重度異常增生，33.3％為原位癌，11.1％為浸潤癌；第28周，22.2％為原位癌，77.8％為浸潤癌。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測法對重度異常增生，原位癌以及鱗癌的敏感性很高，達(dá)78.6％，與細(xì)胞核銀染檢測法具有正相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1使用4NQO水溶液涂抹Wistar大鼠腭部黏膜可以建立動物口腔癌模型，并且動物模型的癌變過程與人