轉染HIF-1α的骨髓間充質干細胞復合納米羥基磷灰石對兔橈骨骨缺損的修復作用.pdf

1、目的：
　　以骨髓間充質干細胞（BMSCs）作為種子細胞，將攜帶低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的慢病毒感染BMSCs后與納米羥基磷灰石人工骨材料（Nano-HA）體外復合培養(yǎng)，植入兔橈骨骨缺損模型，觀察HIF-1α對骨缺損的修復作用。
　　方法：
　　用已構建成功的HIF-1α慢病毒表達質粒和包裝質粒共轉染293Ta細胞，包裝出慢病毒并測出病毒滴度。取兔脛骨的骨髓，使用全骨髓貼壁篩選法結合密度梯度離心法分離培養(yǎng)BM

2、SCs，通過形態(tài)學觀察及流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD90、CD105、CD34、CD45對BMSCs進行鑒定。將攜帶HIF-1α慢病毒感染BMSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察感染效率。將感染攜帶HIF-1α慢病毒后的BMSCs與Nano-HA共培養(yǎng)得到HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA人工骨材料，電鏡掃描法檢測BMSCs在Nano-HA支架的復合情況，沉淀法檢測細胞在支架上的黏附率，CCK-8法檢測支架上細胞增殖效率。將

3、體外復合培養(yǎng)后的人工骨材料植入兔橈骨骨缺損模型，使用新西蘭大白兔40只，隨機分為4組，每組10只：A組植入轉染HIF-1α的BMSCs與Nano-HA復合培養(yǎng)后的人工骨材料（HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA組）、B組植入BMSCs與Nano-HA復合培養(yǎng)后的人工骨材料（BMSCs/Nano-HA組）、C組植入Nano-HA人工骨材料（Nano-HA組），D組不植入任何材料（空白組）。于手術后第4，8，12周分別檢測兔橈

4、骨大體標本、X光、組織切片、生物力學性能并進行統(tǒng)計學分析，觀察比較橈骨缺損的愈合情況。
　　結果：
　　1、將攜帶HIF-1α慢病毒表達質粒轉染293Ta細胞48小時后，收取病毒后，用孔稀釋計數(shù)法計算出病毒滴度為5.0×107TU/ml。用流式細胞儀對細胞表面標記物CD90、CD105和CD34、CD45進行檢測，CD90、CD105陽性率為99.3％，CD34、CD45為陰性。
　　2、BMSCs與Nano-HA共培

5、養(yǎng)：沉淀法檢測轉染HIF-1α后的BMSCs對Nano-HA材料黏附能力隨時間增加而增強；CCK-8法檢測轉染HIF-1α基因后的BMSCs增殖速率變快，Nano-HA材料對BMSCs的增殖無明顯影響；電鏡掃描結果提示細胞在材料表面上生長良好，偽足伸展充分，并且相互連接成片。
　　3、動物實驗：在術后第4、8、12周分別對各組大體標本、X線、組織切片、生物力學性能進行檢測，發(fā)現(xiàn)A組HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA

6、復合人工骨、B組BMSCs/Nano-HA復合人工骨和C組Nano-HA人工骨均可促進骨缺損修復，但A組HIF-1α-eGFP/BMSCs/Nano-HA復合人工骨組的新骨形成量大，骨缺損修復能力明顯優(yōu)于后兩者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　BMSCs作為骨組織工程種子細胞參與成骨，HIF-1α基因促進BMSCs成骨、成血管分化，從而增強新生骨組織的形成能力，更有效地修復骨缺損，Nano-HA具有良好的