ME2小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)和作用機理研究.pdf

1、目的:丙酮酸是三大營養(yǎng)物質(zhì)相互轉(zhuǎn)換的樞紐，NADPH是維持細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽和體內(nèi)許多生化反應的輔酶。腫瘤細胞通過提高谷氨酰胺的代謝來滿足快速增殖和生存對NADPH和丙酮酸的需求。在此過程中，NAD(P)+-依賴的蘋果酸酶2(ME2)將蘋果酸轉(zhuǎn)化成NAD(P)H和丙酮酸，是谷氨酰胺的代謝中關(guān)鍵酶，被認為是一個潛在的抗腫瘤新靶點。目前人源的ME2小分子抑制劑未見報道，因此，建立ME2小分子抑制劑的高通量篩選平臺，尋找ME2的小分子抑制劑

2、為研發(fā)新型抗腫瘤的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法:我們利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，表達純化重組的人源ME2-His融合蛋白。酶標儀監(jiān)測ME2產(chǎn)物NADH在340nm處的特征光吸收強度的變化，計算反應初速度，測定ME2的活性。通過優(yōu)化ME2測活體系中的pH值、緩沖溶液、底物濃度、ME2濃度、DMSO濃度建立ME2小分子抑制劑的高通量篩選體系。用Z'因子、性噪比評價高通量篩選體系。對國家新藥篩選中心化合物庫中化學合成的小分子化合物、網(wǎng)絡藥物發(fā)現(xiàn)平

3、臺天然產(chǎn)物（含中藥有效成分）和天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物進行篩選，尋找對ME2有抑制作用的化合物。通過優(yōu)化ME2的濃度和染料濃度，建立驗證化合物與ME2特異性結(jié)合的熱位移分析體系。通過熱位移分析方法和向篩選體系中加入表面活性劑（如Brij-35）驗證對ME2有抑制作用化合物的特異性。MTS法檢測ME2小分子抑制劑對腫瘤細胞增殖的影響。分析ME2小分子抑制劑與ME2之間的構(gòu)效關(guān)系。通過研究ME2小分子抑制劑對酶動力學的影響，確定抑制劑的抑制類型

4、。
　　結(jié)果:我們在體外表達純化得到純度較高的人源ME2-His融合蛋白。建立了Z'因子為0.775，性噪比為9.83的ME2小分子抑制劑的高通量篩選體系。對國家新藥篩選中心化合物庫中的320，000個化學合成的小分子化合物和網(wǎng)絡藥物發(fā)現(xiàn)平臺的12，683個天然產(chǎn)物（含中藥有效成分）進行篩選，獲得了105個對ME2有抑制作用的化合物。通過熱位移分析方法和向篩選體系中加入表面活性劑驗證活性化合物的特異性，獲得了28個ME2小分子抑制

5、劑，其中12個來源于天然產(chǎn)物。12個天然產(chǎn)物來源的ME2小分子抑制劑中有4個化合物對腫瘤細胞增殖有抑制作用，其中CAS0006-E009對A549、MCF7、K562、HL-60、HCT-15、8226的IC50分別為34.13μmol/L,38.08μmol/L,49.11μmol/L、18.97μmol/L,74.94μmol/L，19.9μmol/L。對CAS0006-E009進行結(jié)構(gòu)改造，獲得了16個結(jié)構(gòu)類似物。16個結(jié)構(gòu)類似物

6、中有5個化合物對ME2的IC50小于20μmol/L。5個結(jié)構(gòu)類似物中只有1個化合物——NPD389對A549、HCT-116的增殖均有較好的抑制作用，其在處理細胞72小時后的IC50分別為31.45μmol/L、11.55μmol/L，而且NPD389能時間依賴性地抑制HCT-116的增殖。得出了ME2小分子抑制劑與ME2之間的構(gòu)效關(guān)系。分子水平的作用機制研究表明NPD389為快結(jié)合抑制劑，其抑制類型為混合型中的非競爭-競爭性抑制劑。