體外不同動態(tài)力學應變對人牙周膜成纖維細胞整合素α-,5-、α-,6-、β-,1-表達和細胞增殖、功能活性的影響的初步研究.pdf

1、在生理狀況下的咀嚼運動或是咬合創(chuàng)傷期、正畸治療或是各種修復體行使功能時，不同的機械力作用于牙體并傳遞到牙周組織，引起包括牙周膜和牙槽骨在內(nèi)的牙周組織的改建。牙周膜成纖維細胞(periodontalligamentfibroblast，PDLF)作為牙周膜中的主要感受性細胞和效應性細胞，對牙周組織的改建起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其增殖活性和功能狀態(tài)的改變也直接反映了牙周組織改建的狀態(tài)。因此，深入研究PDLF在機械應力作用下的生物應答及應答機制是

2、十分必要的。 目的： 本課題旨在通過四點彎曲細胞力學加載裝置對體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞(humanperiodontalligamentfibroblast，HPDLF)進行加載，比較全面地探討了HPDLF在不同作用方式、不同大小和不同作用時間的動態(tài)力學微應變范圍內(nèi)細胞增殖、功能活性及細胞膜表面整合素α5、α6、β1表達的變化。研究動態(tài)力學應變作用下HPDLF的生物學行為的改變，并初步探討機械應力與整合素介導的信號轉(zhuǎn)

3、導的關(guān)系。 四川大學華西口腔醫(yī)學院博士學位論文方法：1.采用刮取剛拔除的牙齒牙根中1/3部位的牙周膜組織的方法進行取材，采用Ⅰ型膠原酶消化+組織塊貼附的方法培養(yǎng)原代細胞并傳代，對細胞進行來源鑒定和堿性磷酸酶(alkalinephosogatase，ALP)染色，觀察細胞的形態(tài)特征，繪制細胞生長曲線。為細胞力學加載實驗準備實驗細胞。 2.將體外培養(yǎng)的HPDLF接種在特制的細胞培養(yǎng)板上，采用四點彎曲細胞力學加載裝置對其進行加

4、載，頻率為0.5Hz，應變幅度分別為1000、2000、4000μstrain的動態(tài)力學微應變(即分別相當于0.1、0.2、0.4％的細胞變形)，加載時間選取的是12hr內(nèi)的不同時間點。通過流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)分析細胞周期的改變，比較全面地探討不同作用方式、大小和時間的動態(tài)力學應變對細胞增殖活性的影響。 3.采用四點彎曲細胞力學加載裝置對體外培養(yǎng)的HPDLF進行加載，通過定量分析的方法，比較全面地探討

5、不同作用方式、大小和時間的動態(tài)力學應變對細胞總蛋白含量和ALP活性的影響。 4.采用四點彎曲細胞力學加載裝置對體外培養(yǎng)的HPDLF進行加載，通過FCM分析不同動態(tài)力學應變對HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表達的影響，初步探討機械應力與整合素介導的信號轉(zhuǎn)導的關(guān)系。 結(jié)果： 1.體外培養(yǎng)獲得了典型的、具有穩(wěn)定增殖特性的HPDLF，適于對細胞進行力學加載實驗。 2.本實驗加載裝置所產(chǎn)生的動態(tài)力學微應變范圍

6、對HPDLF的G0/G1期、S期細胞百分比和增殖指數(shù)PI產(chǎn)生明顯的影響，其中G0/G1期細胞百分比的減少、S期細胞百分比和PI的增加，提示細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，細胞增殖活性增加；而且此影響與應變的作用方式、應變大小、-5-四川大學華西口腔醫(yī)學院博士學位論文作用時司密切相關(guān)。 3.本實驗加載裝置所產(chǎn)生的動態(tài)力學微應變范圍引起了HPDLF總蛋白含量及ALP活性的增高，而且此影響與應變的作用方式、應變大小、作用時間密切相關(guān)；總蛋白含

7、量及ALP活性總蛋白含量及ALP活性的變化趨勢并不完全相同。 4.本實驗證明了未加力條件下體外培養(yǎng)的HPDLF膜表面同時有整合素α5、α6、β1亞單位的表達；而且β1的表達量最高，α5次之，α6較低。動態(tài)力學應變引起了HPDLF膜表面整合素α5、α6、β1表達的上調(diào)，此影響與應變的大小和作用時間密切相關(guān)；在不同亞單位間存在一定的相關(guān)性和差異性。 結(jié)論： 根據(jù)本實驗的上述結(jié)果可以推測，動態(tài)力學應變引起的HPDLF膜

8、表面整合素α5、α6、β1表達的變化，與細胞增殖、合成功能的變化及細胞分化密切相關(guān)。整合素表達的變化早于細胞增殖和功能活性的變化，是一個較早期的細胞應答反應，提示它們之間可能存在著一定的因果關(guān)系。在適宜大小和作用時間的動態(tài)力學應變下，隨著細胞膜表面整合素α5、α6、β1表達的上調(diào)，可能通過引發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)細胞的增生、分化、凋亡以及細胞因子生成等細胞的生理機能，從而表現(xiàn)出細胞增殖活性和合成功能的增加、促進細胞分化。當然細胞內(nèi)

9、還存在其他多種信號傳導途徑對細胞生理機能的調(diào)控。結(jié)果提示，整合素β1亞族可能在HPDLF的力學信號轉(zhuǎn)導和細胞增殖、功能活性方面具有重要的調(diào)控作用。 根據(jù)實驗的研究結(jié)果，在本實驗加載裝置所采用的頻率為0.5Hz，應變幅度為1000、2000、4000μstrain的動態(tài)力學微應變范圍內(nèi)(即分別相當于0.1、0.2、0.4％的細胞變形)，適宜大小和作用時間的力學應變-6-四川大學華西口腔醫(yī)學院博士學位論文既能引起體外培養(yǎng)的HPDLF

10、膜表面整合素α5、α6、β1表達的上調(diào)，細胞增殖活性和合成功能增加、促進細胞分化。結(jié)果提示，在體內(nèi)生理狀況下的咀嚼運動和修復體正常行使功能(即非咬合創(chuàng)傷和正畸加力)，牙周組織受到適宜的機械性應力作用時，HPDLF作為牙周膜中的主要感受性細胞和效應性細胞，對包括牙槽骨在內(nèi)的牙周組織的改建起著關(guān)鍵的調(diào)控作用；其增殖活性和功能狀態(tài)的良性改變也直接反映了牙周組織改建的良性狀態(tài)。 但應當注意的是，體外模擬HPDLF加力的實驗研究由于所用的

11、實驗加載裝置的不同，實驗結(jié)果根據(jù)應力方式、應力大小、應力變化頻率和作用時間的不同而有所差異。因此，本實驗結(jié)果與其他學者的實驗結(jié)果有一定的相關(guān)性，但并不具備可比性。此外，體外模擬HPDLF加力的實驗研究受到一定的局限，不能完全模擬體內(nèi)的受力環(huán)境；同時離體狀態(tài)的細胞由于沒有組織結(jié)構(gòu)的制約，其生物學行為的響應與群體細胞組織化的整體行為響應具有較大的差異性。因此，在分析體外實驗的結(jié)果時，不能簡單地套用到體內(nèi)。本實驗結(jié)果僅在一定程度上從細胞水平和