內質網(wǎng)應激在大鼠酒精性肝病肝細胞調亡中的作用.pdf

1、目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因長期過量飲酒引起的中毒性肝臟疾病。其包括輕癥ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化等類型。ALD的發(fā)病機制復雜,目前尚不完全清楚,內質網(wǎng)應激(ehdoplasmic reticulum stress,ERS)及其介導的肝細胞凋亡可能在其中發(fā)揮重要作用。
　　 ERS指由于各種原因導致細胞內質網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂,鈣穩(wěn)態(tài)失衡,錯誤折

2、疊或未折疊的蛋白質在內質網(wǎng)腔內聚集的一種亞細胞器的病理狀態(tài),它是使錯誤的蛋白質恢復正確構象并能夠進一步加工的必需步驟。ERS是體內的一種自我保護機制,但如果ERS反應過強或持續(xù)時間過長,肝細胞所受損傷過于嚴重,則會啟動細胞凋亡程序,最終導致肝細胞凋亡,從而加重肝臟病變。
　　 以往的研究證實,在ALD中,高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,Hhcy)可誘發(fā)ERS。胱硫醚β合成酶(cystathionin

3、e beta-synthase,CBS)為吡哆醛磷酸依賴性酶,主要在肝臟中合成,是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代謝過程中的關鍵酶,其活性的降低可能是導致高同型半胱氨酸血癥的重要原因。葡萄糖調節(jié)蛋白-78(glucose-regulated protein,GRP78),是內質網(wǎng)內駐留最多的一種分子伴侶。應激狀態(tài)下,GRP78大量表達,與未折疊蛋白結合,恢復蛋白質的正確構象。因此,GRP78被認為是ERS的標志性分子。

4、ERS介導的肝細胞凋亡過程包括細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡及一系列的酶促反應和信號轉導。需鈣蛋白酶2(calpain2)和caspase-12是存在于肝細胞中的半胱氨酸蛋白酶類,可能在此過程中發(fā)揮重要作用。本研究擬用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型,檢測血清總同型半胱氨酸(tHcy)的濃度和肝組織CBS的活性;分別用免疫組化法和RT-PCR法檢測肝組織中GRP-78、calpain2、caspase-12蛋白和mRNA的表達變化;應用TUNEL

5、染色法檢測肝細胞凋亡。以探討內質網(wǎng)應激及其介導的肝細胞凋亡在大鼠酒精性肝病中發(fā)揮的作用。
　　 方法:選用雄性Wister大鼠50只,體重200±20g,正常飼養(yǎng)1周后隨機分出10只為對照組,其余動物采用逐漸增加酒精濃度(濃度30％-60％,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法進行酒精灌胃,分別于4周、8周、12周和16周末禁食12小時后隨機處死動物9只、9只、8只和8只(大鼠在造模過程中死亡6只),留取血清及肝組織標本;檢測

6、血清ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、VLDL、tHcy等生化指標;用比色法測定肝組織勻漿CBS的活性。取部分肝組織冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色,觀察肝細胞脂肪變性情況;另取肝組織制作石蠟切片,分別行蘇木精.伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、天狼紅染色、過碘酸希夫染色(PAS),觀察肝組織普通病理改變,纖維化程度和肝組織胞漿糖原變化;分別用免疫組織化學染色及逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcripti

7、on-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法,檢測肝組織中GRP-78、calpain2、caspase-12蛋白和mRNA的表達情況。采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測肝細胞凋亡。
　　 結果:
　　 1、血清肝功能指標的變化:隨著造模時間的延長,血清ALT和AST水平逐漸升高,CHE水平降低,與正常對照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　

8、2、血清血脂指標的變化:隨著造模時間的延長,血清TG、TC、LDL、VLDL的水平逐漸升高,HDL水平逐漸降低,與正常對照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　 3、肝組織病理學改變:光鏡下,HE染色顯示對照組肝組織肝細胞索以肝小葉中央靜脈為中心呈放射樣排列;隨著造模時間的延長,出現(xiàn)肝細胞腫脹,肝小葉內可見肝細胞小泡性脂肪變性、凋亡小體和壞死灶;模型16周組大鼠肝細胞彌漫性小泡性脂肪變性,竇周纖維化,匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維

9、間隔形成,可見多量凋亡小體和壞死灶。冰凍切片蘇丹Ⅳ染色顯示正常對照組大鼠肝組織無脂肪變性,隨著造模時間延長,肝細胞內有紅色脂滴分布,并逐漸增多,至16周大鼠肝細胞內出現(xiàn)大量紅色脂滴。PAS染色顯示對照組大鼠肝細胞胞漿中出現(xiàn)大量紫紅色顆粒,模型16周僅見少量紫紅色顆粒分布。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無明顯纖維組織增生,隨著造模時間延長,纖維間隔逐漸形成,模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。
　　 4、血清總同型半胱氨酸

10、(tHcy)濃度的變化:隨著造模時間的延長,血清tHcy的濃度逐漸升高,與正常對照組比較P＜0.01。
　　 5、肝組織CBS活性的變化:隨著造模時間的延長,肝組織勻漿CBS的活性逐漸下降,與正常對照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　 6、免疫組化法檢測大鼠肝組織GRP-78、calpain2、procaspase-12蛋白的表達:光鏡下,正常組大鼠肝臟內表達較少的GRP-78、calpain2蛋白,隨著造模時間的

11、延長GRP-78、calpain2蛋白陽性表達逐漸增加,主要表達于肝細胞胞漿內,光鏡下對照組大鼠肝組織有較多procaspase-12的表達,主要表達于肝細胞胞漿內,隨著造模時間的延長陽性表達逐漸減弱。與正常對照組比較P＜0.01。
　　 7、RT-PCR法檢測GRP-78、calpain2、caspase-12 mRNA的表達量:正常組大鼠肝組織中表達GRP-78、calpain、caspase-12mRNA較少,隨著造模時間

12、的延長,GRP-78、calpain、caspase-12mRNA表達量逐漸增加,與正常對照組比較P＜0.01。
　　 8、TUNEL染色法檢測肝細胞凋亡指數(shù):在正常對照組僅有極少量肝細胞凋亡,隨著造模時間的延長,肝細胞凋亡指數(shù)呈上升趨勢,與對照組相比,P＜0.01。
　　 9、肝組織中CBS的表達量與血清tHcy水平呈負相關,相關系數(shù)為-0.632,P＜0.01。
　　 10、血清tHcy水平與肝組織中GRP-

13、78的相對表達量呈正相關,相關系數(shù)為0.617,P＜0.01。
　　 11、肝細胞凋亡指數(shù)與calpain2和caspase-12mRNA表達呈正相關,相關系數(shù)分別為0.959和0.887,P值均小于0.01。
　　 結論:
　　 1、應用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型,該模型肝臟病變如脂肪變性、炎癥反應和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。
　　 2、在大鼠ALD模型中,C