肺泡巨噬細胞鉀離子通道在石英致細胞炎性反應中的作用.pdf

1、吸入含游離二氧化硅的生產性粉塵可導致矽肺。至今矽肺發(fā)病機制仍不明確，目前普遍認為粉塵誘導的長期持續(xù)的肺組織炎癥是矽肺的發(fā)病基礎。肺泡巨噬細胞（Alveolar Macropha ge，AM）是粉塵進入支氣管肺泡后最主要的靶細胞，其與石英塵之間的相互作用是矽肺發(fā)病的關鍵，認為是石英引起肺部炎性反應的早期關鍵環(huán)節(jié)之一。然而AM 在石英塵作用下的早期應答機制仍不是很清楚。近年一些研究已經確認巨噬細胞鉀離子通道（Volta ge depende

2、nt potassium channel）與脂多糖作用下的細胞活化及隨后的功能應答有關。鉀離子通道是細胞膜上的一種跨膜蛋白，不僅受細胞外刺激信號影響，還可通過膜電位改變傳遞信號至胞內。AM 鉀離子通道是否可以作為早期跨膜信號參與粉塵誘導的巨噬細胞炎性反應？據此本研究以AM 電壓依賴性鉀通道為研究對象，探討其在石英致細胞炎性反應中的作用與意義。
　　 第一部分：大鼠肺泡巨噬細胞膜電壓依賴性鉀離子通道膜片鉗研究
　　 目的：

3、建立全細胞膜片鉗記錄模式及穿孔膜片鉗記錄模式，探討大鼠肺泡巨噬細胞膜電壓依賴性鉀通道的電生理特性，并比較這兩種記錄模式的異同。
　　 方法：SPF 級SD大鼠，支氣管肺泡灌洗法收集肺泡巨噬細胞，鋪種在裝有載玻片的24孔板內，于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)2h后，取出玻片置于細胞池中。全細胞膜片鉗玻璃微電極用標準硼硅酸玻璃毛細管分兩步拉制而成，充灌內液后入水阻抗在4～6MΩ；穿孔膜片鉗玻璃微電極用薄壁硼硅酸玻璃毛細管分兩步拉制而

4、成，充灌含制霉菌素的內液后入水阻抗在2～4 MΩ。記錄模式建立后，在-160～60 mV 范圍內給予持續(xù)時間500 ms、以20 mV 去極化躍遷的方波刺激。使用pClamp 9.0軟件進行電流信號分析。鉀通道激活曲線用Boltzma nn方程：G/Gmax=1/{1+exp[ (V0.5-Vm)/k]}進行擬合。
　　 結果：全細胞膜片鉗記錄模式和穿孔膜片鉗記錄模式均可記錄到AM 膜上電壓依賴性的內向整流鉀電流及外向延遲鉀電流

5、。最大激活電壓下，全細胞膜片鉗記錄模式記錄到的外向延遲鉀電流密度為8.32±4.24 pA/pF，內向整流鉀電流密度為-6.77±3.89pA/pF，相應的半數激活電壓分別為-28.69±2.65 mV和-90.04±2.15 mV，斜率因子為28.27±1.27與19.57±2.14；穿孔膜片鉗記錄模式記錄到的AM 膜外向鉀電流密度為9.42±4.41 pA/pF，內向鉀電流密度為-8.49±4.71 pA/pF，同比略大于全細胞記錄

6、結果，相應的半數激活電壓分別為-15.38±2.30mV和-99.04±2.45mV，斜率因子為15.62±2.89和11.97±2.97，明顯不同于全細胞記錄模式所得參數，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 全細胞膜片鉗記錄模式下膜電流在12 min開始有衰減現(xiàn)象，20 min內幾乎衰減完全，穿孔膜片鉗記錄模式下膜電流沒有明顯衰減現(xiàn)象，最長記錄時間可接近40 min。
　　 結論：(1)大鼠AM可表達電壓依賴性內

7、向整流鉀電流和電壓依賴性外向延遲鉀電流兩種。這兩種電流的表達在巨噬細胞個體之間不同，綜合起來主要有三種類型：以外向延遲鉀電流為主，以內向整流鉀電流為主，內向與外向鉀電流表達皆明顯。
　　 (2)兩種記錄模式均可用于AM 電壓依賴性鉀通道的研究，但全細胞膜片鉗更適合短時大量的細胞記錄，而穿孔膜片鉗適合即時觀察毒物或藥物的作用。
　　 (3)全細胞膜片鉗記錄模式實驗參數為：電極選用標準壁厚的電極，入水阻抗控制在4～6 MΩ，

8、刺激電壓脈沖在-160～60 mV之間，記錄應在破膜后10 min內完成；
　　 穿孔膜片鉗記錄模式實驗參數為：電極選用薄壁電極，制霉菌素終濃度400 μg/ml，電極入水阻抗控制在2～4 MΩ間，刺激電壓脈沖在-160～60 mV之間，記錄時間不宜超過40 min。
　　 第二部分：石英顆粒對大鼠肺泡巨噬細胞電壓依賴性鉀離子通道的影響
　　 目的：研究石英顆粒對大鼠AM 電壓依賴性鉀離子通道的影響及其動力學變化

9、，探討AM 鉀離子通道在石英顆粒即時處理或長時間（24 h）處理后的應答變化。
　　 方法：AM 獲取與純化同第一部分，細胞鋪種于裝有載玻片的24孔板內，濃度為1×105個/ml。向培養(yǎng)孔內加入不同濃度的石英顆粒：0 μg/ml、25 μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200 μg/ml，及無定型石英顆粒100 μg/ml。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出進行常規(guī)全細胞膜片鉗實驗，記錄鉀電流變化。
　　 另取未經任

10、何處理的AM 進行穿孔膜片鉗實驗。穿孔膜片鉗建立以后，通過灌流系統(tǒng)使細胞外液以2 ml/min的速度緩慢流過細胞池，用自制注射加樣系統(tǒng)在細胞池入口即時注入25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml的石英顆粒及100 μg/ml的無定型石英顆粒測試液，串聯(lián)刺激模式記錄細胞膜鉀通道的變化。不間斷記錄條件下即時加入石英顆粒，記錄受體依賴的陽離子或陰離子電流。
　　 細胞分離純化后鋪種在96孔板上，細胞濃

11、度調為5×105個/ml，依次加入0 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml的標準石英顆粒及100 μg/ml 無定型石英顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出檢測細胞乳酸脫氫酶（LDH）漏出率及細胞成活率（MTT法）。
　　 結論：石英顆粒對AM外向延遲鉀通道有激活作用，使其開放概率增加，速率增加；
　　 對AM內向整流鉀通道有激活作用，使其開放概率增加，速率增加，但長時間處理激活

12、作用不明顯，石英顆粒不能以受體方式影響AM 電生理活性。提示AM 電壓依賴性鉀離子通道可能是石英顆粒誘導細胞活化的早期信號蛋白之一，參與石英誘導的細胞壞死。
　　 第三部分：電壓依賴性鉀通道在石英致肺泡巨噬細胞活化及損傷中的作用
　　 目的：應用電壓依賴性鉀通道阻斷劑和激活劑，研究大鼠AM 電壓依賴性鉀通道活性在石英顆粒誘導的AM活化、損傷和炎性介質分泌等生物效應的作用及意義。
　　 方法：肺泡灌洗法獲取SD大鼠

13、AM，調整細胞濃度為5×105個/ml 或1×106個/ml（用于TNF-α檢測）鋪種于96孔板內，每孔200 μl。細胞純化后，將鉀通道阻斷劑四乙基銨（TEA，終濃度為2.5 mM、5 mM、10 mM、20 mM）、4 氨基吡啶（4-AP，終濃度0.625 mM、1.25 mM、2.5 mM、5 mM）和激活劑K+（終濃度15 mM、30 mM、60 mM、120 mM）分別與100 μg/ml 石英顆粒同時處理AM，正常培養(yǎng)24

14、h后測定細胞LDH 漏出率、細胞存活率（MTT法），ELISA法測定培養(yǎng)上清液TNF-α含量。
　　 結論：AM 鉀離子通道與石英顆粒誘導的細胞膜損傷及死亡有關，對石英顆粒誘導的AM TNF-α釋放有調節(jié)作用，可能是石英顆粒作用下的早期信號蛋白之一。
　　 第四部分：石英作用下肺泡巨噬細胞鉀離子通道與胞內鈣的關系
　　 目的：應用電壓依賴性鉀通道阻斷劑和激活劑，研究石英顆粒誘導下大鼠肺泡巨噬細胞電壓依賴性鉀通道與

15、胞內鈣離子濃度的關系，探討粉塵誘導的細胞活化損傷信號機制。
　　 方法：SD大鼠肺泡巨噬細胞獲取與培養(yǎng)同第一部分。細胞濃度為1×105個/ml，均勻鋪種在載有玻片的6孔板中，每孔2 ml。細胞純化后，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用Fluo-3/AM 負載細胞30min后，置于激光掃描共聚焦顯微鏡上，激發(fā)波長488 nm，放射波長526 nm，記錄細胞熒光變化，掃描頻率為0.5 Hz。記錄基線平穩(wěn)后（約100 s），即時加入各處理組（100

16、μg/ml 石英顆粒組，100 μg/ml 無定型石英顆粒組，100 μg/ml 石英顆粒與20mM TEA組，100 μg/ml 石英顆粒與5 mM 4-AP組，100 μg/ml 石英顆粒與120 mM K+組），持續(xù)掃描記錄20 min。分析比較各組熒光強度變化。以未加樣時的鈣離子熒光強度作為基礎值，將加樣后的鈣離子熒光強度與之做比，得到標化的鈣離子信號。
　　 結論：石英顆?？芍翧M 迅速啟動鈣信號過程，而無定型石英顆粒