基于微陣列的多重核酸檢測新技術(shù)的開發(fā)及其在轉(zhuǎn)基因作物檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因作物在全球的迅速發(fā)展，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)進(jìn)入市場，其外源插入片段的組成也愈加復(fù)雜化和多樣化，同時(shí)，市場上未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物的非法流通、作物及產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的低水平混雜時(shí)有發(fā)生，這對當(dāng)前轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的檢測提出了很高的要求，亟需能同時(shí)檢測大量靶標(biāo)、快速高效、操作簡單、經(jīng)濟(jì)的檢測方法。然而目前轉(zhuǎn)基因成分的多重檢測方法面臨諸多問題和挑戰(zhàn)，如可并行檢測的靶標(biāo)數(shù)目較少、擴(kuò)增與檢測分開使得檢測步驟多耗時(shí)長、缺乏便攜式檢測平臺等。

2、另一方面，多重核酸檢測在其它諸多領(lǐng)域如疾病診斷、微生物檢測、食品安全以及環(huán)境監(jiān)測等方面也有著迫切的需求，而轉(zhuǎn)基因多重檢測面臨的問題其實(shí)也是當(dāng)前整個(gè)多重核酸檢測領(lǐng)域面臨的共性問題。針對上述問題，在本論文的研究中，我們以引物及反應(yīng)的物理隔離為指導(dǎo)思想，在多個(gè)平臺上成功構(gòu)建了一整套基于微陣列的多重核酸擴(kuò)增及檢測新技術(shù)，將這些方法成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的高通量檢測中，一定程度上解決了當(dāng)前轉(zhuǎn)基因作物檢測面臨的主要問題,同時(shí)也為當(dāng)前整個(gè)多重核酸檢測領(lǐng)

3、域提供了一種新的解決方案。
　　首先，為了提高轉(zhuǎn)基因多重檢測中可并行檢測的靶標(biāo)數(shù)目，本論文以本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的一套基于親疏水微孔陣列芯片的多重PCR方法為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)開發(fā)了一套用于轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)多重并行擴(kuò)增的芯片多重PCR平臺和一張用于識別多種轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)分子的DNA芯片，將二者相結(jié)合，建立了一套目前世界上最高通量的轉(zhuǎn)基因檢測平臺MACRO(Multiplex Amplification on a Chip with Readout on a

4、n Oligo microarray)，能夠在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測91種轉(zhuǎn)基因相關(guān)靶標(biāo)，檢測范圍覆蓋到超過97%的現(xiàn)有商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物品系。同時(shí)，用多種模擬樣本和實(shí)際樣本進(jìn)行測試的結(jié)果表明本方法的特異性接近100%，靈敏度滿足轉(zhuǎn)基因日常檢測的實(shí)際要求，實(shí)驗(yàn)室自配復(fù)雜樣本和海關(guān)抽檢盲樣的檢測結(jié)果分別與理論預(yù)期和當(dāng)前轉(zhuǎn)基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)real-time PCR方法檢測的結(jié)果100%一致。本方法是世界上第一個(gè)可全局性監(jiān)測轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的多重檢

5、測方法，對日常轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的檢測和監(jiān)管有著重要的實(shí)際意義。
　　接著，針對當(dāng)前方法中擴(kuò)增及檢測分開增加了操作步驟和檢測時(shí)間的問題，本論文進(jìn)一步對MACRO技術(shù)平臺進(jìn)行了改進(jìn)，建立了集擴(kuò)增與檢測于一體的FLAC（Fluorescent-Labeled Amplification and analysis on Chip）多重檢測平臺。我們采用TaqMan probe技術(shù)，對芯片PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，同時(shí)在芯片PCR后用蓋片的簡

6、單方式對芯片進(jìn)行封閉，使得芯片PCR后可以直接通過芯片掃描儀讀取熒光信號，實(shí)現(xiàn)了芯片PCR產(chǎn)物的在片檢測，使原本的檢測時(shí)間縮短了一半以上。我們將此方法用于轉(zhuǎn)基因檢測中，選擇了一些重要的的高頻轉(zhuǎn)基因元件以及轉(zhuǎn)基因作物的植物內(nèi)源參照基因進(jìn)行測試，成功實(shí)現(xiàn)了對19種轉(zhuǎn)基因相關(guān)靶標(biāo)的一次性并行快速檢測，結(jié)果初步表明本方法具有很高的特異性和靈敏度。
　　最后，為了提高多重核酸檢測的便攜性，本論文利用和前述方法中同樣的引物及反應(yīng)物理隔離的思路

7、，設(shè)計(jì)制作了一種集成毛細(xì)管陣列的多重微反應(yīng)器，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合可視化LAMP技術(shù)，開發(fā)了一套簡單快速且經(jīng)濟(jì)的便攜式多重核酸可視化檢測平臺CALM（Capillary Array-based LAMP for Multiplex visual detection of nucleic acids）。在該方法中，我們通過特殊的毛細(xì)管微陣列設(shè)計(jì)和親疏水處理，同時(shí)對加樣裝置進(jìn)行了巧妙的設(shè)計(jì)，可以用移液器一次性將反應(yīng)液非常方便地加入所有毛細(xì)管中并

8、同步進(jìn)行擴(kuò)增及檢測。本方法能在半小時(shí)到一小時(shí)之內(nèi)完成反應(yīng)及檢測，且結(jié)果可直接肉眼檢測，無需配套檢測設(shè)備。本平臺簡單便攜、對儀器和電力依賴低，未來有望用于現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測（point of care test，POCT）等領(lǐng)域。在本論文中，我們同樣將此方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測，成功實(shí)現(xiàn)了對8種常見轉(zhuǎn)基因相關(guān)靶標(biāo)的快速可視化多重檢測。模擬樣本和實(shí)際樣本測試的結(jié)果表明本方法具有很高的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度和實(shí)用性。
　　綜上所述，本論文針對轉(zhuǎn)基

9、因作物檢測和整個(gè)多重核酸檢測領(lǐng)域面臨的問題和挑戰(zhàn)，以多種形式的微陣列為載體、以引物及反應(yīng)的物理隔離為指導(dǎo)思想，建立了一整套簡便通用的多重核酸檢測方法，這些方法可大大提高多重核酸檢測的重?cái)?shù)，同時(shí)又兼具高特異性和靈敏度、方法簡便、靈活、通用等優(yōu)點(diǎn)。所有這些方法均被成功地應(yīng)用于對多重核酸檢測有著迫切需求的轉(zhuǎn)基因作物檢測中，顯示了良好的效果和相比其它傳統(tǒng)檢測方法的優(yōu)勢，因此，這些方法在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域有著現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也為當(dāng)前多重核酸檢測領(lǐng)