暗紋東方鲀體內細菌類群組成分析及產(chǎn)河鲀毒素菌株的篩選.pdf

1、關于河鲀魚體內河鲀毒素的起源，至今為止仍無定論。近二十年來，大量研究發(fā)現(xiàn)寄生于魚體內的部分細菌被證實能夠產(chǎn)河鲀毒素。許多研究者認為這些細菌主要是通過食物鏈進入魚體。為了了解餌料對魚體內細菌組成的影響，本文以暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，通過對投喂不同餌料的魚體部分組織腸道、表皮、性腺和肝臟中細菌類群組成分析，并對其中特異的弧菌組成作了進一步分析，來探討?zhàn)D料對各組織內細菌類群組成影響。然后試圖通過分離到產(chǎn)河鲀毒素細菌，為今后研究河鲀毒素產(chǎn)生機制作

2、基礎。本文在研究魚體內細菌組成時采用PCR-DGGE分子生物學策略以分析16SrDNA特征序列對細菌類群進行鑒定，并結合培養(yǎng)、未培養(yǎng)的細菌類群組成差異進行分析。主要研究結果如下： 1.暗紋東方鲀的腸道、表皮、性腺和肝臟組織的細菌組成。共得到80種不同細菌，其中未經(jīng)培養(yǎng)而直接來源于組織樣品的細菌為34種；經(jīng)選擇性培養(yǎng)基PCA、TCBS培養(yǎng)后的混合細菌中共獲得49種，其中3種與未培養(yǎng)的完全一致。在對直接來源于組織中的34種不同細菌的

3、16SrDNA特征序列分析，結果表明，占優(yōu)勢的是γ亞群的變形細菌(γ-Proteobacteria)，共17種，占50％；其次為低G+C含量的G+細菌，8種，占23.5％；CFB類僅3種，占8.8％；此外，α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、ε-Proteobacteria、螺旋體類及高G+C含量的G+細菌各1種；而培養(yǎng)后的細菌幾乎都是γ-Proteobacteria類細菌，僅在TCBS培養(yǎng)基上獲得5株低

4、G+C含量的G+細菌。其中腸道內未經(jīng)培養(yǎng)的細菌主要有：低G+C含量的G+細菌(6種，占46％，歸屬于芽孢桿菌屬、乳球菌屬、肉桿菌屬和毛球菌屬)、γ-Proteobacteria(4種，占31％，歸屬于希瓦菌屬和弧菌屬)以及ε-Proteobacteria、β-Proteobacteria和螺旋體類；表皮中含有：γ-Proteobacteria(10種，占55.6％，歸屬于氣單胞菌屬、希瓦菌屬、假交替單胞菌屬以及假單胞菌屬等)、CFB類細

5、菌(3種，占16.7％，歸屬于擬桿菌綱和黃桿菌科)、低G+C含量的G+細菌的乳桿菌屬(2種)以及各1種的α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和高G+C含量的G+細菌的考克氏菌屬；性腺和肝臟組織中，γ-Proteobacteria(13種，占52％，分別歸屬于沙雷菌屬、弧菌屬、希瓦菌屬、假交替單胞菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬等)、低G+C含量的G+細菌(7種，占28％，集中在芽孢桿菌屬、乳球菌屬、肉桿菌屬和乳

6、桿菌屬)、CFB類的黃桿菌科細菌以及α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和高G+C含量的G+細菌。 不同組織間細菌類群差別，腸道與性腺肝臟組織及表皮中細菌組成差別較大，而后兩者之間差別不大。主要表現(xiàn)在腸道中含有特有的ε-變形細菌和螺旋體類細菌，但是，未分離到CFB類和高G+C含量的G+細菌。 2.不同餌料喂養(yǎng)的暗紋東方鲀的腸道、表皮、性腺和肝臟組織的細菌組成的差別。腸道內以天然餌料鮮活魚蝦飼

7、養(yǎng)的暗紋東方鲀(N組)與人工餌料飼養(yǎng)的暗紋東方鲀(C組)差別較明顯：N組包含乳球菌屬、肉桿菌屬、芽孢桿菌屬、希瓦菌、弧菌以及α-Proteobacteria和β-Proteobacteria類細菌；而C組則包括螺旋體、低G+C含量的G+細菌毛球菌屬、ε-Proteobacteria和弧菌屬。性腺和肝臟、表皮內差別不是很顯著。 3.不同餌料喂養(yǎng)的暗紋東方鲀的腸道、表皮、性腺組織的弧菌組成。共鑒定出暗紋東方鲀體內18種細菌，其中7種

8、為未培養(yǎng)細菌類特有的，約占39％。所有細菌均歸屬于變形細菌(Proteobacteria)的gamma亞群，其中13種為弧菌科細菌，3種為腸桿菌科細菌，2種為氣單胞菌屬細菌。經(jīng)不同飼料喂養(yǎng)的河鲀各組織的細菌組成的差異性，腸道最大，性腺次之，表皮最小。 4.產(chǎn)河鲀毒素細菌分離。從暗紋東方鲀腸道等組織中共分離到30株單菌落，經(jīng)初步檢測，證明菌株Ne3能夠產(chǎn)河鲀毒素。通過對Ne3菌株的部分生物學特征鑒定并結合16SrDNA全長序列的遺