水稻光敏感雄性核不育基因pms1的克隆與功能分析.pdf

1、水稻是全球一半以上人口的主糧，如何提高水稻產量一直是各國科學家致力于解決的關乎國計民生的重大課題。50年前袁隆平先生提出了雜交稻的構想，并隨后將之應用于生產實踐中，為我國糧食安全做出了巨大的貢獻。中國雜交稻的生產經歷了從三系稻到兩系稻的發(fā)展，兩系稻占我國雜交稻種植面積的比例越來越高。相對于三系不育系，兩系不育系恢復系廣、配組更為自由，大大簡化了雜交過程，應用潛力巨大。兩系不育系是指光溫敏雄性不育系，其育性受到溫度和光照長度的影響:光敏不

2、育系在長日照下不育、短日照下可育;溫敏不育系在高溫下不育、低溫下可育。粳稻品種農墾58S是第一個被發(fā)現(xiàn)也是研究和應用最廣泛的光敏雄性不育系，以農墾58S為基因源培育出了大批優(yōu)良的光溫敏雄性不育系。為了更好地利用兩系不育系，有必要分離控制光溫敏雄性不育性的基因并闡明其分子作用機理。pms1是農墾58S中控制光敏雄性核不育的主效基因，我們構建了農墾58S與明恢63的高世代回交群體以圖位克隆pms1基因并對其進行功能分析，得到的主要研究結果如

3、下:
　　1.與以往的認識不同，通過對農墾58S與明恢63回交F2群體的結實率和基因型分析表明，光敏感雄性核不育基因pms1是一個不完全顯性基因。在長日照下BC5F2群體中純合的農墾58S pms1位點表現(xiàn)為完全不育;純合的明恢63 pms1位點表現(xiàn)為完全可育;而雜合基因型的育性呈現(xiàn)出從不育到可育連續(xù)分布的趨勢，并且絕大部分植株育性低于60％。明恢63純合、雜合及農墾58S純合這三種基因型單株數的比例符合1∶2∶1的單基因分離比。

4、
　　2.在確定了pms1顯隱性的基礎上對6841個BC5F2群體單株用兩端分子標記pj23和Fssr進行基因型分析，共得到88個重組單株。再利用新開發(fā)的11個分子標記進一步縮小定位區(qū)間。由于雜合基因型單株與農墾58S純合基因型單株間育性的重疊，為了定位的可靠性，僅利用雜合基因型和明恢63純合基因型發(fā)生交換的重組單株進行精細定位。最終將pms1定位于分子標記P4和P6之間4.0 kb的范圍內，左右各1個重組單株，分子標記P5與pm

5、s1共分離。
　　3.將農墾58S中包含有該4.0 kb的基因序列互補轉化到近等基因系NIL(MH)中，能降低受體長日照下的育性，短日照下無影響;反之，將對應來自于明恢63中的序列轉化到農墾58S中沒有表型的改變，說明該區(qū)域內確實包含有pms1的候選基因。
　　4.采用RACE的方法在定位區(qū)間內分離到一條全長cDNA，將此轉錄本命名為PMS1T。在長日照下抑制農墾58S中PMS1T的表達能夠恢復育性，NIL(MH)中抑制PM

6、S1T的表達對育性無影響;在NIL(MH)中超量表達PMS1T也能導致育性下降。這些結果都表明PMS1T就是控制光敏雄性不育的基因pms1。
　　5.對PMS1T表達譜分析發(fā)現(xiàn)PMS1T在與花粉發(fā)育相關的組織中表達量較高，在營養(yǎng)生長器官中表達量很低，并且在二次枝梗原基分化期、雌雄蕊形成期和花粉母細胞形成期的幼穗中優(yōu)勢表達，這三個時期也正是光敏感雄性不育的敏感時期。qPCR結果表明在這三個時期中長日照下農墾58S中PMS1T的表達量

7、低于NIL(MH)及短日照下的農墾58S和NIL(MH)。
　　6.PMS1T在農墾58S和明恢63中的長度分別為1，453 bp和1，388bp，兩者相差65bp。在PMS1T的5'端還存在兩個SNP位點S1和S2，SNP S2和分子標記P5與pms1共分離。在多個水稻品種中對這幾個序列差異進行比較測序表明SNP S2是造成光敏雄性不育的功能性突變。
　　7.PMS1T沒有intron，位于基因間區(qū)，沒有基因注釋。預測有三

8、個短的ORF，將農墾58S這三個預測ORF的起始密碼子ATG后面插入堿基“G”，分別互補轉化NIL(MH)，仍然能夠正常發(fā)揮功能，降低NIL(MH)的育性，說明PMS1T不編碼蛋白，是一個長鏈非編碼RNA。
　　8.5' RLM-RACE和降解組測序數據證實了PMS1T能夠被miR2118剪切。對長、短日照下農墾58S和NIL(MH)雌雄蕊形成期、花粉母細胞形成期和減數分裂期幼穗進行Small RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)PMS1T能夠

9、從miR2118剪切位點開始形成18對21ntphasiRNA。這些PMS1T-phasiRNA的表達量在花粉母細胞形成期和減數分裂期幼穗中高于雌雄蕊形成期，其中4s phasiRNA和6s phasiRNA的量遠高于其他phasiRNA。比較分析花粉母細胞形成期幼穗中的PMS1T-phasiRNA，在長日照下的農墾58S中表達量高于其他三種材料。同時發(fā)現(xiàn)PMS1T-phasiRNA的表達量與PMS1T轉錄本的表達量呈負相關。此外還分析

10、了長日照花粉母細胞形成期幼穗中PMS1T-phasiRNA在轉基因植株中的表達量。在超量表達農墾58SPMS1T轉基因植株中，phasiRNA的表達量在陽性植株中高于陰性植株;與此相吻合的是，農墾58S PMS1T抑制表達的轉基因陽性單株中phasiRNA的表達量低于陰性單株。這些結果表明PMS1T-phasiRNA與光敏雄性不育相關。轉基因結果進一步證實失去了完整miR2118識別位點的農墾58S PMS1T不能發(fā)揮正常功能來降低NI