紫肉甘薯花色素苷生物合成相關轉錄因子克隆與功能分析.pdf

1、紫肉甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是一種薯皮為紫黑色、肉質為紫紅色的甘薯類型,屬于旋花科甘薯屬蔓生習性草本植物。紫肉甘薯塊根中紫皮和紫肉均可食用,食味甘而甜,纖維少,口感較好,富含淀粉、維生素、氨基酸等多種營養(yǎng)成分,其提取物具有抗壞血酸、抗癌、抗高血糖、抗動脈粥樣硬化、抗突變、抗菌作用等多種藥理作用。這些藥理作用大部分都與紫肉甘薯中富含的花色素苷有關。紫肉甘薯中花色素苷含量為20-180 mg/100 g鮮重。紫

2、肉甘薯塊根中浸提的花色素苷是優(yōu)質天然花色素苷,可以替代人工合成色素,在食品、醫(yī)藥、化妝品方面有著較大應用潛力。
　　 花色素苷是水溶性黃酮類色素中最重要的一類,是花色素與各種單糖通過糖苷鍵形成的糖基化衍生物總稱,屬于植物次生代謝產物.花色素苷經(jīng)苯丙氨酸合成途徑和類黃酮生物合成途徑合成,生物合成途徑需一系列酶催化和轉錄因子調控.花色素苷合成途徑調控主要是受R2R3-MYB類、bHLH類和WD40類轉錄因子的調控,且一般是由MYB、

3、bHLH和WD40蛋白形成蛋白復合體,直接調控結構基因轉錄。為研究紫肉甘薯中花色素苷生物合成途徑中的調控機理,為花色素苷次生代謝工程提供新靶點,本研究采用RACE技術首次從渝紫263中克隆出來自MYB、bHLH和WD40家族與花色素苷合成相關的5個基因,并進行生物信息學分析。此外,還采用HPLC和比色法對渝紫263各組織中花色素苷含量進行分析。
　　 MYB類轉錄因子家族相關基因的調節(jié)活性是自然界中植物著色模式多變的主要原因,R

4、2R3MYB家族與類黃酮和花色素苷生物合成途徑調控緊密相關。本研究采用RACE技術,克隆渝紫263中R2R3MYB家族的一個基因的全長cDNA,并命名為IbMYB1(GenBank登錄號為:JQ337861)。生物信息學分析表明,IbMYB1基因的cDNA全長1198 bp(不含ployA),包含長度為750 bp的編碼框,長為184 bp的5'-端非翻譯區(qū)和長為164 bp的3'-端非翻譯區(qū)。預測結果表明IbMYB1基因編碼249個氨

5、基酸的蛋白質,該蛋白質分子量大小為28.6kDa,等電點(pI)為8.57,為堿性蛋白,包含36.55%的α-螺旋、8.03%的延伸鏈、4.42%的β-轉角和51.0%不規(guī)則卷曲。氨基酸序列的多重比對表明,IbMYB1與植物中已鑒定的R2R3MYB轉錄因子序列保守區(qū)主要存在于N-端R2R3 DNA結合結構域,其C-端相在各物種間相似性很低。三級結構預測也顯示IbMYB1三級結構只在R2R3區(qū)域建模成功,與雞MYB蛋白的R2R3結構域(1

6、A5J)類似,R2和R3結構域分別由2個和3個α-螺旋組成。將IbMYB1與其它植物中MYB類轉錄因子進行進化樹構建分析表明,IbMYB1與大多數(shù)已鑒定調控花色索苷生物合成的MYB轉錄因子聚為一支。采用熒光定量PCR對IbMYB1進行在渝紫263組織表達譜分析結果表明在塊根中表達量最高,其次是直徑0.5 cm塊根(Φ0.5塊根)、外周皮、莖節(jié)、莖間、葉柄、須根、葉和幼莖尖.
　　 bHLH類轉錄因子能夠識別花色素合成途徑中關鍵酶

7、基因啟動子區(qū)域的E-BOX(CANNTG)。其與DNA結合時,通常需要兩個不同bHLH轉錄因子形成二聚體才能完成。本研究通過RACE技術,從渝紫263中成功克隆bHLH家族中的兩個基因,分別命名為IbbHLH1和IbbHLH2,登錄號為分別:JQ337862和JQ337863。生物信息學分析表明,IbbHLH1基因cDNA全長為2467 bp,長度為1890 bp的編碼框,5'-UTR長為427 bp和長為150 bp的3'-UTR。其

8、編碼629個氨基酸的蛋白質,預測該蛋白分子量大小為69.5kDa,等電點為5.10,為酸性蛋白,包含α-螺旋34.82%、延伸鏈9.38%、β-轉角2.86%和不規(guī)則卷曲52.94%。IbbHLH2基因cDNA序列全長2280 bp,包含了編碼框長度為2025 bp,5'-UTR長為108 bp,3'-UTR長147bp。IbbHLH2基因編碼674個氨基酸的蛋白質,預測結果顯示該蛋白分子量大小為75.1 kDa,等電點為5.07,為酸

9、性蛋白,包含α-螺旋45.40%、延伸鏈10.83%、β-轉角4.60%和不規(guī)則卷曲39.17%。氨基酸序列多重比對表明,雖IbbHLH1和IbbHLH2分別聚為不同支,但它們在靠近N-端的一部分和HLH結構域部分相似性較高。三級結構預測兩個蛋白只有在HLH結構域部位建模成功,預測結構中IbbHLH1和IbbHLH2均由兩個α-螺旋和中間連接的不規(guī)則卷曲組成,與DNA結合的活性部位位于蛋白的N-端。采用熒光定量PCR對IbbHLH1和I

10、bbHLH2在渝紫263組織表達譜分析結果表明,IbbHLH1在須根中表達量最高,其次是葉柄、幼莖尖和莖間、塊根、Φ0.5塊根、莖節(jié)、葉和外周皮;而IbbHLH2在Φ0.5塊根中表達量很高,在塊根和外周皮中表達量也相對較高,其在其它的組織中都表達量很低。
　　 WD40類轉錄因子在多種植物中被鑒定為激活花色素苷轉錄復合體必不可少的轉錄因子。本研究通過RACE技術,從渝紫263中成功克隆了WD40家族中的兩個WD40基因,分別命名

11、為IbWDR1和IbWDR2,基因登錄號分別為:JQ340206和JQ337864。生物信息學分析表明,IbWDR1的cDNA序列全長1239 bp,包含了長度為1032 bp的編碼框,長為64bp的5'-UTR和長為143 bp的3'-UTR。IbWDR1編碼343個氨基酸的蛋白質,該蛋白分子量為38.09kDa,等電點為4.97,為酸性蛋白,包含α-螺旋10.20%、延伸鏈34.99%、β-轉角3.50%和不規(guī)則卷曲51.31%。I

12、bWDR2的cDNA序列全長1299 bp,包含了長度為1041 bp的編碼框,長為136 bp的5'-UTR和長為121 bp的3'-UTR,編碼346個氨基酸的蛋白質,蛋白分子量為39.09 kDa,等電點(pI)為4.71,為酸性蛋白,包含α-螺旋10.40%、延伸鏈32.37%、β-轉角4.91%和不規(guī)則卷曲52.31%。多重比對表明,IbWDR1和IbWDR2在各物種相對比較保守,特別是蛋白質中間偏后的一部分。三級結構預測結果

13、顯示,IbWDR1和IbWDR2均具由7個區(qū)域圍成一個環(huán)狀的結構,并且每個區(qū)域都是有4個β-延伸鏈組成。渝紫263組織表達譜分析結果表明,IbWDR1和IbWDR2在各組織中表達量均相對較高,IbWDR1在葉柄、幼莖尖、Φ0.5塊根和外周皮中表達量比莖間、須根、塊根、莖節(jié)和葉相對高一些;IbWDR2的表達量在Φ0.5塊根、塊根和幼莖尖比其它組織要高些,其它組織依次是莖節(jié)、須根、葉柄、外周皮、葉和莖間。
　　 本實驗采用10 mL

14、1%甲酸化甲醇作為提取液,提取渝紫263各組織的花色素苷,分別用HPLC和紫外分光光度計對花色素苷進行含量檢測,構建渝紫263的組織含量譜。通過含量分析表明,外周皮中的花色素苷含量最高,其次是塊根和基部莖,在葉和葉柄中花色素苷的含量都較低。
　　 對IbMYB1、IbbHLH1、IbbHLH2、IbWDR1和IbWDR2基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解這三類轉錄因子在花色素苷的生物合成中的作用,并為今后調控花色素