蛋白酶Corin在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化過程中corin的表達(dá)
　　目的：Corin是心臟中發(fā)現(xiàn)的一種II型跨膜絲氨酸蛋白酶，在調(diào)節(jié)血壓和維持心臟功能方面起重要作用。除心臟外，corin也表達(dá)于其它組織，如腎臟、骨骼組織、妊娠子宮等。最近有研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）中也有corin表達(dá)，為進(jìn)一步探討corin在MSCs中的作用，本研究通過檢測(cè)MSCs分化過程中corin mRNA及

2、蛋白的表達(dá)，探討corin與BM-MSCs分化的關(guān)系，為進(jìn)一步研究蛋白酶corin的功能及其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用提供依據(jù)。
　　方法：
　?。?）收集正常骨折病人骨髓，采用密度梯度離心法收集含有MSCs的低密度層，獲取原代MSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　?。?）取第三代MSCs，在特定誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞，并通過特異性染色和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse tr

3、anscription PCR， RT-PCR）法進(jìn)行鑒定。
　　（3）利用RT-PCR技術(shù)對(duì)MSCs定向分化過程中corin mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析。
　　（4）利用實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)MSCs分化過程中corin mRNA的表達(dá)水平，并進(jìn)行定量分析。
　?。?）免疫熒光染色檢測(cè)MSCs成軟骨分化中corin蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　

4、?。?）我們收集了8例正常骨折病人骨髓，均培養(yǎng)出原代MSCs細(xì)胞，細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)排列呈螺旋狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞基本保持長梭形的形態(tài)。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)CD44、CD73、CD90而不表達(dá)CD34。
　?。?）通過茜素紅染色、油紅O染色、阿爾新藍(lán)染色分別檢測(cè)BM-MSCs成骨、成脂、成軟骨分化的可行性，我們觀察到被茜素紅染成紅色的鈣結(jié)節(jié)，被油紅 O染成深紅色的脂肪小滴，被阿而新藍(lán)染成藍(lán)色的硫酸多聚糖。
　　（3）

5、通過RT-PCR及qRT-PCR檢測(cè)到BM-MSCs向成骨、脂肪、成軟骨細(xì)胞分化過程中均有 corin表達(dá)，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，corin的相對(duì)表達(dá)量逐漸增多（p<0.05 vs.0 d）。
　?。?）通過qRT-PCR觀察到BM-MSCs在成軟骨分化4 w時(shí)corin mRNA表達(dá)量最高，我們選取4 w時(shí)成軟骨分化細(xì)胞微球，通過免疫熒光染色檢測(cè)到分化后的BM-MSCs中corin蛋白表達(dá)陽性。
　　結(jié)論：
　?。?

6、）原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛，傳代以后純化度可達(dá)90%以上，傳至10代以上仍能保持固定的長梭形細(xì)胞形態(tài)。
　?。?）BM-MSCs具有很強(qiáng)的多向分化特性，可作為細(xì)胞工程中理想的種子細(xì)胞。
　?。?）在BM-MSCs分化過程中，通過RT-PCR和免疫熒光法均檢測(cè)到corin的表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，corin表達(dá)量逐漸增高，說明corin有可能參與了BM-MSC分化過程。
　　第二部分 BM-MSCs成軟骨分化過程中

7、corin的表達(dá)及其功能研究
　　目的：骨性關(guān)節(jié)炎是中老年人最常見的慢性軟骨損傷性疾病之一，其發(fā)病機(jī)理主要是以軟骨慢性磨損為特點(diǎn)。我們前期的研究顯示，在BM-MSCs向成軟骨細(xì)胞分化時(shí)，corin表達(dá)量顯著增高，為研究corin在BM-MSCs向成軟骨分化中的作用，我們采用RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)將BM-MSCs中corin mRNA特異性沉默，并觀察沉默后的BM-MSCs細(xì)胞成軟骨能力的改變

8、。
　　方法：
　?。?）采用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒，并轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293-corin細(xì)胞，用于抑制corin mRNA的表達(dá)，通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)干擾效率，并篩選出最優(yōu)病毒株，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的BM-MSCs。
　?。?）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)corin被抑制后的BM-MSCs遷移能力。
　?。?）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)corin被抑制后的BM-MSCs增殖能力。
　?。?）免疫組織

9、化學(xué)方法檢測(cè)corin基因被抑制后BM-MSCs成軟骨分化能力的變化，并用Image Pro-Plus軟件分析IHC圖片中陽性染色區(qū)域的平均光密度，評(píng)價(jià)正常BM-MSCs及干擾后BM-MSCs誘導(dǎo)后特異性指標(biāo)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　（1）利用HEK293-corin細(xì)胞篩選最佳病毒株，通過qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)病毒侵染后的HEK293-corin細(xì)胞中corin mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)第V2LH

10、S_12562株病毒沉默效果最好，將這株病毒侵染BM-MSCs發(fā)現(xiàn)corin mRNA抑制了80%以上，而對(duì)照組corin mRNA僅沉默了5%左右（p<0.01 vs. siCTRL）。
　?。?）抑制BM-MSCs中corin mRNA表達(dá)對(duì)BM-MSCs細(xì)胞的遷移及增殖能力均未有顯著影響。
　?。?）抑制BM-MSCs中corin mRNA表達(dá)影響了BM-MSCs向成軟骨分化，檢測(cè)軟骨特異性的硫酸化多糖和II型膠原蛋白

11、的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其形成量明顯減少，IPP軟件分析siCORIN組和siCTRL組中圖片藍(lán)色及棕色區(qū)域面積，發(fā)現(xiàn)其面積均明顯減少（硫酸化多糖面積：18.9%vs.60.6%, p<0.01;II型膠原蛋白面積：11.4%vs.39.5%, p<0.05）。同時(shí)通過qRT-PCR法檢測(cè)軟骨特異性基因COL2A1和COMP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量也明顯降低（*p<0.05；**p<0.01 vs. siCTRL）。
　　結(jié)論：
　　我們通