偽狂犬病病毒gE基因缺失株(LA--A株)的構(gòu)建及免疫效力研究.pdf

1、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的豬的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的急性、熱性傳染病。免疫接種基因缺失株的弱毒疫苗是防控偽狂犬病的有效途徑之一。然而，自2011年以來(lái)，新的豬偽狂犬病疫情在中國(guó)北方的某些豬場(chǎng)最先爆發(fā)，盡管這些豬場(chǎng)都免疫過(guò)了Bartha-K61株等PRV疫苗，之后疫情逐步向全國(guó)大部分養(yǎng)豬場(chǎng)蔓延。研究表明此次疫情是由毒力

2、明顯變強(qiáng)的PRV變異毒株引起的。有研究結(jié)果顯示PRV弱毒疫苗Bartha-K61雖然仍能提供一定的臨床保護(hù)，但不能提供足夠的保護(hù)力以完全抵御此次流行的毒株，尤其對(duì)攻毒后的排毒保護(hù)效果很不理想。因此研制出一種針對(duì)PRV變異株的新型疫苗是我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的緊迫需求。
　　本研究室從安徽省六安市某豬場(chǎng)的發(fā)病豬中分離了一株豬源偽狂犬病病毒株，該毒株能引起9周齡仔豬發(fā)病死亡，其毒力顯著增強(qiáng)，命名為AH02LA株。進(jìn)一步以PRV AH02LA株基因

3、組DNA為模板，分別擴(kuò)增出gE基因兩側(cè)的序列H1、H2作為同源重組臂，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）為篩選標(biāo)記，構(gòu)建了GFP轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pPRV-GFP(gE-)。采用磷酸鈣吸附法將pPRV-GFP(gE-) DNA與PRV-AH02LA病毒DNA共轉(zhuǎn)染原代CEF細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后在紫外光（波長(zhǎng)488nm）激發(fā)下觀察細(xì)胞病變，挑取發(fā)出綠色熒光的蝕斑，經(jīng)過(guò)3～4輪挑斑篩選和傳代，獲得純化的的

4、重組病毒，命名為PRV AH02LA-GFP(gE-)。然后構(gòu)建質(zhì)粒pUC19-(PRVgE-)R，該質(zhì)粒包含完整的gI基因和gE基因ORF的一部分(1299bp-1735bp)以及上下游序列，同樣采用磷酸鈣吸附法將pUC19-(PRV gE-)R DNA與重組病毒PRVAH02LA-GFP（gE-）DNA共轉(zhuǎn)染原代CEF細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后在紫外光（波長(zhǎng)488nm）激發(fā)下觀察細(xì)胞病變，挑取不發(fā)綠色熒光的蝕斑，經(jīng)過(guò)2～3輪挑斑篩選和傳代，

5、獲得純化的偽狂犬病病毒gE單基因缺失株，命名為偽狂犬病病毒LA-A株。
　　對(duì)偽狂犬病病毒gE基因缺失株（LA-A株）的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定。將PRV LA-A株分別感染CEF和BHK-21細(xì)胞，觀察病變情況并繪制PRV LA-A株在CEF和BHK-21細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線;用TCID50法檢測(cè)CEF和BHK-21細(xì)胞的病毒效價(jià)，結(jié)果顯示，PRV LA-A株在CEF和BHK-21細(xì)胞中均能增殖，達(dá)到較高的病毒效價(jià)，PRV LA

6、-A株感染CEF細(xì)胞的病毒效價(jià)平均為106.5TCID50/mL，感染BHK-21細(xì)胞的病毒效價(jià)平均為107.8TCID50/mL。病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)顯示，PRV LA-A株在CEF和BHK-21細(xì)胞上有相似的增殖周期，即在接毒一定時(shí)間內(nèi)增殖能力顯著上升，其后增殖平緩，甚至下降;但增殖效價(jià)有較大差異;從病毒的體外生長(zhǎng)曲線可以看出，gE基因缺失病毒PRV LA-A株和親本病毒AH02LA株具有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，在36h～48h都達(dá)到峰值，滴

7、度最高可達(dá)109.5TCID50/mL以上，說(shuō)明gE基因的缺失對(duì)病毒的復(fù)制幾乎沒(méi)有影響。
　　安全性試驗(yàn)表明偽狂犬病病毒LA-A株對(duì)4周齡仔豬安全，且可以通過(guò)常規(guī)鑒別診斷方法區(qū)別偽狂犬病病毒LA-A株免疫豬只與自然感染豬只。對(duì)偽狂犬病病毒gE基因缺失株（LA-A株）滅活疫苗與偽狂犬活疫苗（Bartha-K61株）進(jìn)行免疫效力比較研究，免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明免疫Bartha K61株疫苗對(duì)免疫組豬僅能產(chǎn)生部分保護(hù)，不能阻止發(fā)病和排毒。