卵巢衰老體外細胞模型及抗苗勒管激素用于早期評估預警系統(tǒng)的建立.pdf

1、1小鼠卵巢竇前卵泡不同分離方法的比較
　　本研究的目的是探討小鼠竇前卵泡的最佳分離方法。取未成熟小鼠的卵巢,按照不同分離方法,單純機械法或酶解法分離竇前卵泡,并用基礎培養(yǎng)液進行培養(yǎng),比較不同分離方法獲得的卵泡數量、形態(tài),及對其早期生長發(fā)育的影響。其中2mg/ml的膠原酶可獲得大量基底膜完整的竇前卵泡及裸卵(P<0.01);體外培養(yǎng)2天后,酶解組卵泡生長直徑大(P<0.05)、GVBD率、放出第一極體率和7天生存率無明顯差異(P>0

2、.05)。由此可見膠原酶酶解法較單純機械法更易獲得大量高質量竇前卵泡,且對其早期發(fā)育無明顯影響。
　　2小鼠卵巢顆粒細胞體外原代培養(yǎng)體系的建立
　　本研究的目的是探討基礎培養(yǎng)基、添加因子與血清相比,對乙烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)處理的C57BL/6J未成年小鼠顆粒細胞(granulosa cells, GCs)增殖的影響,以建立一個無血清的體外原代培養(yǎng)體系,添加因子包括 ITS(為5 mg/ m

3、l胰島素,5 mg/ ml轉鐵蛋白和5 g/ ml亞硒酸鈉的混合物),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),丙酮酸鈉(sodium pyruvate,PNa)和表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF);此后,將此無血清培養(yǎng)體系用于評價這些添加因子對顆粒細胞甾體合成過程的影響以及相關的調節(jié)機制。DMEM/F12, McCoy’s5a, RPMI Medium1640, Medium

4、199, a-MEM被選為基礎培養(yǎng)基,其中McCoy’s5a能有效的促進顆粒細胞的增殖(P<0.05)并且顆粒細胞貼壁及形態(tài)均較好。顆粒細胞在有血清的培養(yǎng)基中較無血清的生長狀態(tài)更佳; ITS,牛血清白蛋白,丙酮酸鈉和表皮生長因子在無血清狀態(tài)下對顆粒細胞增殖的促進能力逐漸增加,其中后三者在無血清的體系下擁有與血清相同的促顆粒細胞增殖能力。經過2天得培養(yǎng),原代培養(yǎng)的細胞仍然為表達芳香化酶陽性的顆粒細胞,且維持正常的形態(tài),當添加因子加入到無血

5、清的體系中時,這些細胞亦無凋亡的表現。在所有的添加因子中僅有 ITS能夠誘導雌二醇的產生,同時ITS、牛血清白蛋白和丙酮酸鈉能明顯的增加孕酮的分泌提示其能促進細胞的分化。這些添加因子的作用通過部分增加類固醇生成性急性期調節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、3β羥類固醇脫氫酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)、膽固醇側鏈裂解

6、酶(Cholesterol Side-Chain Cleavage Enzyme,P450scc)或芳香化酶(aromatase,P450arom)的轉錄水平達到。因此,McCoy’s5a培養(yǎng)基是一個較好的基礎培養(yǎng)基,ITS和丙酮酸鈉在無血清體系中同時促進原代顆粒細胞的增殖和分化,為顆粒細胞的生理學研究提供優(yōu)良的培養(yǎng)體系。
　　目的:闡明生殖衰老分期系統(tǒng)(the Stages of Reproductive Aging Works

7、hop stages, STRAW)中不同分期階段及不同年齡階段各種卵巢衰老相關指標的變化,確定最佳反映卵巢衰老的指標用于制定女性卵巢功能的參考值范圍,建立卵巢衰老的評價標準;并通過區(qū)分生育年齡中期(mid reproductive age stage,MR)完善 STRAW分期。
　　實驗設計及方法:根據 STRAW分期系統(tǒng)將18至74歲的健康女性進行分類,并檢測月經第三天血清基礎卵泡刺激素(follicle-stimulati

8、ng hormone,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)和抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone,AMH)的水平以及卵泡期竇狀卵泡數(antral follicle counts, AFCs);記錄另一組女性中行 IVF治療的獲卵數及受孕結果。
　　結果:在生育年齡中期細分的情況下,隨著整個STRAW分期系統(tǒng)的推進,血清FSH, LH水平及F

9、SH/LH比值逐漸上升,血清 E2, AMH水平和AFCs逐漸下降(P<0.001)。血清 AMH(r=-0.679/-0.742)和AFCs(r=-0.620/-0.673)與 STRAW分期緊密相關,且在25歲較早的時候就出現了明顯的下降( P<0.01),并和生育年齡中期階段的年齡緊密相關(r=-0.451,-0.445,)。因此 AMH和AFCs作為最佳卵巢衰老指標制定參考值范圍;此外,0.982 ng/ml AMH和3個竇狀卵

10、泡數(生育年齡中期25-30歲的較低水平)可作為臨界值區(qū)分生育年齡中期為生育年齡早中期(early mid reproductive age,EMR)和生育年齡晚中期( late mid reproductive age,LMR)。EMR較 LMR女性可在 IVF中獲取更多的卵母細胞(P<0.05);雖無統(tǒng)計學差異,由 AMH水平區(qū)分的EMR相對于 LMR受孕率稍高(57.9％)。
　　結論:血清 AMH水平和AFCs早期就會出現

11、顯著的下降,可作為卵巢衰老較佳的指標評價卵巢功能;并進一步區(qū)分和定義生育年齡中期,顯示了STRAW分期系統(tǒng)中年輕女性不同的卵巢衰老階段,為 IVF治療及生育計劃提供參考。
　　2卵巢衰老指標用于預測絕經年齡及構建卵巢衰老預警系統(tǒng)
　　目的:絕經年齡個體差異性較大。本研究的目的是利用數學模型的方法比較不同年齡相關的卵巢內分泌和影像學指標在正?？稍信灾蓄A測終末絕經時間的能力(final menopause period,FMP

12、)并最終構建卵巢衰老預警系統(tǒng)。
　　方法:我們檢測了358名正常健康可孕中國漢族女性的血清基礎抗苗勒管激素(anti-müllerian hormone, AMH),卵泡刺激素(follicular stimulating hormone, FSH)水平和竇狀卵泡數量(Antral follicle counts, AFCs),利用這些指標與年齡構建模型并找出最佳擬合效果的方程式。繼而通過最大似然估計的閾值方法計算出相應樣本可能的

13、絕經年齡,這些指標預測FMP的能力由它們預測的絕經年齡分布與實際的絕經年齡分布的匹配度確定。最終,根據每位女性的實際指標水平和年齡位于預測絕經年齡分布的百分比區(qū)段位置預測絕經年齡,達到預警目的。
　　結果: logAMH的二次回歸擬合, FSH的三次回歸擬合和AFCs的線性回歸分別最佳的反映了相應指標與年齡的關系(R2=0.634,0.595和0.320)。血清AMH的下降比 FSH的升高平均早4.5年,因此內分泌學指標中,AMH

14、被選為較佳的指標與影像學指標-AFCs相比預測絕經年齡。由 AMH指標模擬計算獲得的預測絕經年齡分布與實際絕經年齡分布在41歲到53歲間有較好的一致性,比AFCs的擬合效果更好。最終,二次方程擬合的AMH聯合實際年齡可以通過相應的百分比區(qū)段位置預測絕經年齡范圍。
　　結論:血清AMH水平是一個較FSH和AFCs更佳的指標來預測女性個體的絕經年齡,與實際年齡合并可預測終末絕經時間,早期預示卵巢功能的下降。
　　第三部分綜述-卵

15、巢衰老評價與預測指標的研究現狀
　　卵巢功能衰退引起的生育能力下降、圍絕經期癥狀及老年性疾病嚴重影響和危害女性的身體健康及家庭幸福。因此,卵巢功能的評價及卵巢衰老的預測亦日益受到關注。隨著年齡的增長,卵泡數量及質量不斷下降,卵巢功能隨之減退,最終發(fā)生衰老-絕經。因此卵泡數與女性生育能力及內分泌功能直接相關,成為檢測卵巢功能的主要對象。目前關于卵巢衰老的檢測主要從卵巢功能的內分泌學指標、影像學指標及組織學檢測等方面直接或間接地反應卵