Notch信號負調節(jié)因子SEL1L對體外培養(yǎng)小鼠切牙頸環(huán)細胞凋亡的影響.pdf

1、牙冠發(fā)育完成后，上皮根鞘（Hertwig’sepithelialrootsheath，HERS）的形成啟動了牙根發(fā)育已成為共識，然而牙根發(fā)育啟動的分子機制尚不明了。嚙齒類動物切牙根尖端唇側干細胞龕可以持續(xù)分化成釉細胞并形成釉質，使切牙終生持續(xù)生長。而磨牙則跟人類的牙齒一樣形成HERS，啟動了牙根發(fā)育。因此嚙齒類動物切牙常作為牙根發(fā)育障礙的研究模型。Notch信號有助于維持切牙頸環(huán)干細胞龕，SEL1L是Notch信號的負調節(jié)因子。前期研究

2、發(fā)現SEL1L在磨牙強陽性表達，切牙弱陽性表達，推測SEL1L有助于打破頸環(huán)干細胞微環(huán)境，形成HERS并啟動牙根發(fā)育。
　　本研究采用體外細胞培養(yǎng)、免疫組織化學、細胞轉染、RT-PCR等技術手段實現體外培養(yǎng)切牙頸環(huán)細胞SEL1L過表達，觀察其對頸環(huán)細胞凋亡的影響，以探討SEL1L是否通過促進頸環(huán)細胞的凋亡，打破了頸環(huán)結構中的干細胞微環(huán)境，從而使頸環(huán)結構轉變?yōu)殡p層細胞的上皮根鞘結構，啟動了牙根發(fā)育。主要內容和結果如下：
　　實

3、驗一酶消化組織塊法原代培養(yǎng)小鼠切牙頸環(huán)上皮細胞
　　取出生后7～8天（postnatal7-8day,PN7～8d）的昆明小鼠，斷頸處死后提取切牙根尖端唇側頸環(huán)組織。I型膠原酶和dispaseⅡ蛋白酶混合液消化后接種組織塊進行原代細胞培養(yǎng)，胰酶差別消化法去除成纖維細胞以獲得純化的上皮細胞。免疫組化檢測上皮細胞標記物角蛋白的表達。結果發(fā)現3-7天后組織塊周圍可見梭形成纖維細胞及多角形上皮細胞混合存在，采用胰酶差別消化后得到多角形、聚

4、集生長鋪路石樣純化的上皮細胞，角蛋白陽性表達。本實驗采用酶消化組織塊法成功培養(yǎng)切牙頸環(huán)上皮細胞，角蛋白免疫染色驗證其為上皮來源。操作簡便易學，兼具酶消化法及組織塊法的優(yōu)點。小鼠切牙頸環(huán)上皮細胞成功培養(yǎng)為進一步研究目的分子SEL1L的功能打下了基礎。
　　實驗二小鼠pEGFP-N2-SEL1L表達載體鑒定及頸環(huán)細胞轉染
　　采用DH5α感受態(tài)細胞轉化并篩選pEGFP-N2-SEL1L重組質粒，目的基因PCR及酶切鑒定目的基因陽

5、性表達的重組質粒后測序。選取濃度及純度適合的質粒利用脂質體2000轉染頸環(huán)上皮細胞。結果發(fā)現16～18h后可見單個克隆菌落長出，挑取菌落并搖菌，提取質粒。PCR可見目的基因條帶，單酶切及雙酶切后均可見相應DNA條帶。測序結果顯示目的基因與GenBank數據庫中SEL1L基因高度重合。轉染24h后熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光表達。本實驗成功提取并鑒定目的基因SEL1L已與空白質粒相連接的重組質粒；并采用脂質體2000成功轉染頸環(huán)上皮細胞，

6、實現SEL1L的過表達。
　　實驗三pEGFP-N2-SEL1L轉染小鼠切牙頸環(huán)上皮細胞鑒定及凋亡檢測
　　RT-PCR檢測轉染后頸環(huán)上皮細胞SEL1L、Notch1及Hes1的表達，判斷目的基因是否成功轉染，SEL1L表達是否上調。采用DAPI染色進行凋亡細胞形態(tài)學觀察，RT-PCR檢測凋亡相關基因Caspase-3及Bcl-2的表達。結果發(fā)現與空載體對照組相比較，重組質粒組SEL1LmRNA表達增強，Notch1及Hes

7、1mRNA表達減弱。重組質粒組細胞呈凋亡形態(tài)改變的明顯多于空載體對照組，Caspase-3mRNA表達增強，Bcl-2mRNA表達減弱。本實驗采用RT-PCR檢測SEL1L、Notch1及Hes1mRNA的表達，進一步驗證了已將pEGFP-N2-SEL1L重組質粒成功轉染切牙頸環(huán)細胞，并且SEL1L可發(fā)揮功能；采用DAPI染色及RT-PCR技術成功檢測出SEL1L過表達的頸環(huán)上皮細胞凋亡率增加。
　　綜上所述，本研究發(fā)現SEL1L