PAMAM納米材料及碳納米管的毒性研究.pdf

1、1. PAMAM G3通過AKT-TSC2—mTOR通路引起A549自噬性細胞死亡，并導(dǎo)致小鼠急性肺損傷。 聚酰胺—胺樹枝狀大分子納米材料(PAMAM dendrimer)是一種具有高度支化、對稱、呈輻射狀的大分子。它由中心核、內(nèi)層重復(fù)的分支亞單位以及表面的功能基團組成。整代的PAMAM納米材料表面的功能基團為氨基，半代的PAMAM納米材料表面的功能基團為羧基。由于氨基帶有正電荷，整代的PAMAM常被用作載體，遞送DNA，進行細

2、胞或生物體內(nèi)表達。然而，對于這些PAMAM材料的生物安全性卻了解甚少。 在本文中，測定了PAMAM G1—G8以及G3.5、G4.5、G5.5和G7.5對A549細胞的影響。發(fā)現(xiàn)從PAMAM G3開始，到PAMAM G8均會引起A549細胞的死亡。而表面基團為陰離子的半代PAMAM對A549的活性不會產(chǎn)生影響。對PAMAM G3引起的A549死亡進行了分析，發(fā)現(xiàn)PAMAM G3引起的A549死亡不是通過凋亡通路，而是引起A549

3、自噬性細胞死亡。自噬的抑制劑3MA或是利用siRNA技術(shù)抑制自噬基因ATG6的表達，可以有效地緩解PAMAM G3引起的A549細胞死亡。同時，自噬性細胞死亡也在PAMAM G4、G5、G6、G7和G8引起的A549細胞死亡中扮演著重要角色。 同時，對PAMAM G3引起的自噬性細胞死亡的信號通路進行了分析。發(fā)現(xiàn)PAMAM G3可以通過AKT-TSC2—mTOR的信號通路引起A549發(fā)生自噬性細胞死亡。 而且，發(fā)現(xiàn)PAM

4、AM G3會導(dǎo)致小鼠死亡，引起小鼠急性肺損傷。而自噬的抑制劑3MA會有效地緩解PAMAM G3引起的小鼠死亡，改善小鼠急性肺損傷程度。說明自噬在PAMAM G3引起的小鼠死亡中發(fā)揮著重要作用。 2. 表面為COOH修飾的單壁碳納米管引起A549發(fā)生自噬性細胞死亡。 碳納米管(Carbon NanoTubes，CNT)是碳原子之間形成化學(xué)鍵組成的管狀結(jié)構(gòu)。CNT通常有兩種形式：單壁碳管(single—walled carb

5、on nanotubes，SWCNT)，由一層碳原子網(wǎng)組成，直徑范圍0.6—2.4納米；多壁碳管(multi—walled carbon nanotubes，MWCNT)，由多于一層的同圓心的單壁碳管套疊在一起形成，直徑范圍10-200納米。 由于其表面受到不同功能基團所修飾，碳納米管可能會表現(xiàn)出截然不同的性質(zhì)。在本章中，發(fā)現(xiàn)表面功能基團為COOH的單壁碳管會引起A549細胞發(fā)生自噬，并導(dǎo)致A549細胞死亡。而自噬的抑制劑3MA

6、會有效的抑制COOH單壁碳管引起的A549細胞死亡。 而且，發(fā)現(xiàn)COOH單壁碳管也會引起A549細胞中磷酸化AKT/總AKT，以及磷酸化mTOR/總mTOR的比值出現(xiàn)下調(diào)，與PAMAM G3引起的A549細胞死亡有相同的信號通路。對COOH單壁碳管的進一步研究仍在進行之中。 3. 多壁碳納米管通過不依賴于caspase—3的途徑引起A549細胞凋亡。 本研究發(fā)現(xiàn)多壁碳管可以引起A549細胞的死亡，而且通過細胞流式

7、的方法判定多壁碳管可以引起A549細胞的凋亡。但是這種凋亡并不激活A(yù)549細胞的caspase—3的活性，同時，caspase的光譜抑制劑Z—VAD—fmk對多壁碳管引起的細胞凋亡無緩解作用，說明多壁碳管是通過一條不依賴于caspase—3的信號通路來引起A549細胞凋亡。 4. 刺突蛋白表達引起HEK293T細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并干擾胰島素信號通路。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是分泌性或是膜定位蛋白質(zhì)進行修飾、折疊的場所。未折疊或是折疊錯誤的

8、蛋白過量積累會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有研究表明，全長的刺突蛋白表達會引起細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在本文中，發(fā)現(xiàn)刺突蛋白的S2片段(S681—1190)的表達是引起HEK293T細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因。 而且，發(fā)現(xiàn)S2或全長刺突蛋白的表達會干擾胰島素的信號通路，降低胰島素引起的磷酸化AKT/總AKT的比值。本文推測S2或全長刺突蛋白表達引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是干擾胰島素信號的原因，相關(guān)的研究正在進行之中。 5. 刺突蛋白中內(nèi)毒素的去除以及刺

9、突蛋白引起人外周血單核細胞的炎性因子的分析。 SARS冠狀病毒的感染可以引起患者體內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，引起血液中炎性因子的升高。用最初表達的刺突蛋白刺激人外周血單核細胞，發(fā)現(xiàn)可以引起大量TNF—a，IL-1β，IL—6以及IFN—γ的分泌。 經(jīng)內(nèi)毒素檢測試劑檢測后，本研究發(fā)現(xiàn)最初表達的刺突蛋白中含有大量的內(nèi)毒素。經(jīng)內(nèi)毒素去除柱去除其中的內(nèi)毒素后，內(nèi)毒素指標(biāo)合格的刺突蛋白也會引起人外周血單核細胞分泌TNF—a與IL—6，